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Sep 06, 2023

Diseño de novo de biosensores de proteínas modulares y sintonizables

Naturaleza volumen 591, páginas

Nature volumen 591, páginas 482–487 (2021)Citar este artículo

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Los interruptores de proteínas naturales se han reutilizado para el desarrollo de biosensores e indicadores para aplicaciones celulares y clínicas1. Sin embargo, la cantidad de interruptores de este tipo es limitada y su reingeniería es un desafío. Aquí mostramos que se puede crear una clase general de biosensores basados ​​en proteínas invirtiendo el flujo de información a través de interruptores de proteínas diseñados de novo en los que la unión de una clave peptídica desencadena resultados biológicos de interés2. Los sensores diseñados son dispositivos moleculares modulares con un estado oscuro cerrado y un estado luminiscente abierto; la unión del analito impulsa el interruptor del estado cerrado al abierto. Debido a que el sensor se basa en el acoplamiento termodinámico de la unión del analito a la activación del sensor, solo se requiere un dominio de unión objetivo, lo que simplifica el diseño del sensor y permite la lectura directa en la solución. Creamos biosensores que pueden detectar con sensibilidad la proteína antiapoptosis BCL-2, el dominio IgG1 Fc, el receptor HER2 y la neurotoxina botulínica B, así como biosensores para la troponina cardíaca I y un anticuerpo contra el virus de la hepatitis B con alta sensibilidad. necesarios para detectar clínicamente estas moléculas. Dada la necesidad de herramientas de diagnóstico para rastrear el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2)3, utilizamos el enfoque para diseñar sensores para la proteína de punta del SARS-CoV-2 y anticuerpos contra las proteínas de membrana y nucleocápside. El primero, que incorpora un aglutinante del dominio de unión al receptor (RBD) diseñado de novo4, tiene un límite de detección de 15 pM y una señal de luminiscencia 50 veces mayor que el nivel de fondo. La modularidad y la sensibilidad de la plataforma deberían permitir la construcción rápida de sensores para una amplia gama de analitos y destaca el poder del diseño de proteínas de novo para crear sistemas de proteínas multiestado con funciones nuevas y útiles.

Los biosensores basados ​​en proteínas tienen funciones importantes en la biología sintética y las aplicaciones clínicas, pero hasta ahora el diseño de biosensores se ha limitado principalmente a la reingeniería de proteínas naturales1. Encontrar dominios de unión a analitos específicos que experimenten cambios conformacionales al unirse es un desafío, e incluso cuando están disponibles, generalmente se requieren esfuerzos extensos de ingeniería de proteínas para acoplarlos de manera efectiva a un dominio informador5,6. Por lo tanto, es deseable construir plataformas de biosensores modulares que se puedan reutilizar fácilmente para detectar diferentes objetivos proteicos de interés. Se han desarrollado sistemas modulares para detectar anticuerpos7,8,9 y moléculas pequeñas10,11, pero los sensores de proteínas generales son un desafío mayor dada la gran diversidad de estructuras, tamaños y estados de oligomerización de proteínas, y enfoques como las plataformas de proteínas semisintéticas12,13,14 , o cambios de calmodulina15,16, por lo general requieren una evaluación considerable para encontrar candidatos potenciales debido a la previsibilidad limitada17.

Un biosensor de proteínas se puede construir a partir de un sistema con dos estados casi isoenergéticos, cuyo equilibrio entre los cuales está modulado por el analito que se detecta. Las propiedades deseables en un sensor de este tipo son: (i) el cambio conformacional desencadenado por un analito debe ser independiente de los detalles del analito, por lo que el mismo sistema general puede usarse para detectar muchos objetivos diferentes; (ii) el sistema debe ser ajustable para que los analitos con diferentes energías de unión y diferentes concentraciones típicas puedan detectarse en un amplio rango dinámico; y (iii) el cambio conformacional debe estar acoplado a una salida sensible. Presumimos que estos atributos podrían lograrse invirtiendo el flujo de información en interruptores de proteínas diseñados de novo en los que la unión a una proteína objetivo de interés está controlada por la presencia de un péptido activador2. Desarrollamos un sistema que constaba de dos componentes proteicos: primero, un 'lucCage' que comprende un dominio de jaula y un dominio de cierre que contiene un motivo de unión al objetivo y un fragmento de luciferasa dividido (BiT pequeño (SmBiT) 114)18; y segundo, un 'lucKey' que contiene un péptido clave que se une al estado abierto de lucCage y al fragmento de luciferasa dividido complementario (BiT grande (LgBit) 11S)18 (Fig. 1a). lucCage tiene dos estados: un estado cerrado, en el que el dominio de la jaula se une al pestillo y ocluye estéricamente el motivo de unión para que no se una al objetivo y SmBiT para que no se combine con LgBit para reconstituir la actividad de la luciferasa, y un estado abierto, en el que estas interacciones de unión son no está bloqueado y lucKey puede vincularse al dominio de la jaula. La asociación de lucKey con lucCage da como resultado la reconstitución de la actividad de la luciferasa (Fig. 1a, derecha). La termodinámica del sistema se ajusta de tal manera que la energía libre de unión de lucKey a lucCage (ΔGCK) es insuficiente para superar el costo de energía libre de la apertura de lucCage (ΔGopen) en ausencia del objetivo (ΔGopen − ΔGCK >> 0), pero en la presencia del objetivo, la energía libre de unión adicional del pestillo al objetivo (ΔGLT) impulsa la apertura del pestillo y la reconstitución de luciferasa (ΔGopen - ΔGCK - ΔGLT << 0) (Fig. 1b, c). Este sistema satisface las propiedades (i) y (ii) anteriores, ya que se puede enjaular una amplia gama de actividades de enlace, y debido a que el interruptor se controla termodinámicamente, las energías de enlace lucKey y objetivo se pueden ajustar para lograr la activación en las concentraciones objetivo relevantes. Debido a que lucKey y lucCage son siempre iguales, el sistema es modular: la misma asociación molecular se puede acoplar a la unión de muchos objetivos diferentes. La bioluminiscencia proporciona una lectura rápida y sensible de la asociación lucCage-lucKey impulsada por el analito, lo que satisface la propiedad (iii).

a, Mecanismo esquemático del sensor. La forma cerrada de lucCage (izquierda) no puede unirse a lucKey, lo que evita que el fragmento SmBiT de luciferasa dividido interactúe con LgBit. La forma abierta (derecha) puede unirse tanto al objetivo como a la clave, lo que permite la reconstitución de SmBiT y LgBiT para la actividad de luciferasa. b, Termodinámica de la activación del biosensor. El costo de energía libre (ΔGopen) de la transición de jaula cerrada (especies 1) a jaula abierta (especies 2) desfavorece la asociación de la clave (especies 5) y la reconstitución de la actividad de luciferasa (especies 6) en ausencia del objetivo. En presencia del objetivo, las energías libres combinadas de la unión del objetivo (2→3; ΔGLT), la unión de teclas (3→4; ΔGCK) y la asociación SmBiT–LgBiT (4→7; ΔGR) superan la desfavorable ΔGopen, impulsando la apertura del lucCage y la reconstitución de la actividad de la luciferasa. c, Termodinámica del diseño de biosensores. Los parámetros que se pueden diseñar son ΔGopen y ΔGCK; ΔGR es el mismo para todos los objetivos y ΔGLT está preespecificado para cada objetivo. Para una detección de analito de fondo sensible pero baja, ΔGopen y ΔGCK deben ajustarse de modo que el estado cerrado (especie 1) tenga una energía libre sustancialmente menor que el estado abierto (especie 6) en ausencia del objetivo, pero una energía libre mayor que el estado abierto en presencia del objetivo (especie 7).

Los estados de este sistema biosensor están en equilibrio termodinámico, con los parámetros ajustables ΔGopen y ΔGCK que rigen las poblaciones de las posibles especies, junto con la energía libre de asociación del analito al dominio de unión ΔGLT (Fig. 1b). Simulamos la dependencia del sistema sensor de ΔGopen (datos extendidos Fig. 1a), ΔGLT (datos extendidos Fig. 1b) y la concentración de analito y los componentes del sensor (datos extendidos Fig. 1c, d). La sensibilidad de la detección del analito es una función de ΔGLT, con un límite inferior de aproximadamente una décima parte de la constante de disociación (Kd) para la unión del analito (Datos ampliados, Fig. 1b). Por encima de este límite inferior, variar la concentración de lucCage y lucKey permite que el sistema responda a diferentes rangos de concentración objetivo (Datos extendidos Fig. 1c, d). La sensibilidad se puede modular aún más ajustando la fuerza de la interacción jaula-cierre intramolecular y la interacción jaula-clave intermolecular (ΔGopen y ΔGCK, respectivamente); por ejemplo, una interacción jaula-cierre demasiado apretada da como resultado una señal baja en presencia del objetivo, y una interacción demasiado débil da como resultado una señal de fondo alta en ausencia del objetivo (Datos extendidos Fig. 1a, e). Nuestra estrategia de diseño tiene como objetivo encontrar este equilibrio mediante la modulación de ΔGopen y ΔGCK variando la longitud de la hélice del pestillo (y la llave) e introduciendo interacciones polares enterradas hidrofóbicas favorables o desfavorables en las interfaces jaula-cierre o jaula-llave2 (Fig. 1f, g).

Para diseñar sensores basados ​​en estos principios, desarrollamos un método basado en Rosetta 'GraftSwitchMover' para identificar ubicaciones de péptidos de unión al objetivo dentro del pestillo de modo que la proteína resultante sea estable en el estado cerrado y las interacciones con el objetivo estén bloqueadas (Métodos complementarios ). Como primera prueba, injertamos el péptido SmBiT y el péptido BIM en el estado cerrado del interruptor LOCK2 asimétrico optimizado descrito anteriormente (Datos extendidos Fig. 2). SmBiT adopta una conformación de hebra β dentro de la holoenzima luciferasa, pero asumimos que podría adoptar una estructura secundaria helicoidal en el contexto del andamio del haz helicoidal, porque la estructura secundaria puede depender del contexto19. Tomamos muestras de diferentes ubicaciones para las dos secuencias de péptidos en el pestillo, seleccionamos las soluciones de energía más baja (Datos extendidos, Fig. 2a) y expresamos 12 diseños en Escherichia coli. Mezclamos los diseños con lucKey en una proporción de 1:1, luego agregamos BCL-2, que se une a BIM con afinidad nanomolar20, y observamos un rápido aumento en la luminiscencia (Datos extendidos Fig. 2b, f; nos referimos al mejor de estos como 'lucCageBIM'), lo que demuestra que el actuador LOCKR2 operado en reversa puede funcionar como un biosensor. El rango de detección del analito podría ajustarse variando la concentración del sensor (lucCage más lucKey) (Datos extendidos Fig. 2g), como se anticipó en las simulaciones de nuestro modelo (Datos extendidos Fig. 1c). lucCageBIM tiene SmBiT en la posición 312 del pestillo (SmBiT312) (Datos ampliados Fig. 2d); la jaula con esta ubicación (lucCage) se utilizó como andamio base para los biosensores que se describen a continuación.

A continuación, investigamos la incorporación de una variedad de modalidades de unión para analitos de interés dentro de lucCage mediante el desarrollo de métodos para enjaular computacionalmente proteínas de unión a objetivos, en lugar de péptidos, en estado cerrado (Métodos complementarios). Como caso de prueba, enjaulamos la proteína de unión a hemaglutinina (HA)21 de influenza A H1 diseñada de novo HB1.9549.2 en una versión abreviada de LOCKR switch22 (sCage), optimizada para mejorar la estabilidad y facilitar los esfuerzos de cristalización (Fig. 2a). Dos de los cinco diseños eran funcionales y limitaban HA en presencia pero no en ausencia de clave (Datos extendidos Fig. 3b). La estructura cristalina del mejor diseño, sCageHA_267-1S, determinada con una resolución de 2,0 Å (Tabla complementaria 1, código 7CBC del banco de datos de proteínas (PDB), mostró que todos los residuos de la interfaz de unión a HA excepto uno (Phe273) interactúan con el dominio de la jaula (bloqueando la unión del pestillo al objetivo) según lo previsto por el diseño (Fig. 2a, Datos extendidos Fig. 3a–c).

a, Validación estructural de sCageHA_267-1S, que enjaula una proteína de unión a la influenza diseñada dentro de un interruptor LOCKR. A la izquierda, modelo de diseño del aglutinante de novo HB1.9549.2 (cinta cian) unido a la región del tallo de la hemaglutinina de influenza (HA, cinta verde)21. Derecha, estructura cristalina (código PDB 7CBC) de sCageHA_267_1S, que comprende HB1.9549.2 (cian) injertado en una versión acortada y estabilizada del interruptor LOCKR22 (sCage, cinta amarilla). Medio, todos los residuos de HB1.9549.2 involucrados en la unión a HA (magenta, arriba) excepto F273 están enterrados en el estado cerrado del interruptor (abajo). Las etiquetas magenta indican el mismo conjunto de aminoácidos en los dos paneles (por ejemplo, F2 en el panel superior corresponde a F273 en el panel inferior). b–d, Caracterización funcional de lucCageBot (b), lucCageProA (c) y lucCageHER2 (d). A la izquierda, los modelos estructurales incorporan un aglutinante diseñado de novo para BoNT/B (Bot.671.2)21 (b) el dominio C de la proteína A (SpA C)23 (c) o un aficuerpo de unión a HER224 (d) en lucCage (azul cinta) con fragmento SmBiT enjaulado (cinta dorada). Medio, medición de la intensidad de la luminiscencia tras la adición de 50 nM de analito (BoNT/B (b), IgG Fc (c) o HER2 (d)) a una mezcla de 10 nM de cada lucCage y 10 nM de lucKey. Derecha, detección en una amplia gama de concentraciones de analitos cambiando la concentración del biosensor (lucCage más lucKey) (líneas de colores). Todos los experimentos se realizaron por triplicado, se muestran datos representativos y los datos son la media ± sd

Con esta validación estructural del concepto de diseño, buscamos desarrollar sensores para la neurotoxina botulínica B (BoNT/B), el dominio Fc de inmunoglobulina y el receptor HER2. Injertamos un aglutinante diseñado de novo para la neurotoxina botulínica (Bot.0671.2)21, el dominio C de la proteína A23 de unión a anticuerpos genéricos y un affibody24 de unión a HER2 en lucCage. Después de seleccionar algunos diseños para cada objetivo (datos extendidos, Figs. 4, 5), obtuvimos lucCages altamente sensibles (lucCageBot, lucCageProA y lucCageHER2) que pueden detectar BoNT/B (Fig. 2b, datos extendidos Fig. 4), IgG humana Dominio Fc (Fig. 2c, Datos extendidos Fig. 5a–d) y receptor HER2 (Fig. 2d, Datos extendidos Fig. 5e–h), respectivamente, lo que demuestra la modularidad de la plataforma. Los sensores diseñados responden minutos después de agregar el objetivo, y su sensibilidad se puede ajustar cambiando la concentración de lucCage y lucKey (Fig. 2). Con un mayor desarrollo, estos sensores podrían permitir la detección rápida y económica de neurotoxinas botulínicas en la industria alimentaria25, y la detección de niveles serológicos de HER2 soluble (>15 ng ml−1; dentro del rango de detección de lucCageHER2) asociados con cáncer de mama metastásico. cáncer26.

A continuación, diseñamos sensores para la troponina I cardíaca, que es el biomarcador de diagnóstico temprano estándar para el infarto agudo de miocardio27. Aprovechamos las interacciones de alta afinidad entre las troponinas cardíacas T, C e I (cTnT, cTnC y cTnI, respectivamente) (Fig. 3a) y diseñamos 11 candidatos a biosensores mediante la inserción de 6 secuencias de cTnT truncadas en diferentes posiciones de cierre (Figura de datos ampliados). 6a). El mejor candidato, lucCageTrop627, fue capaz de detectar cTnI pero no a niveles suficientemente bajos para uso clínico, ya que los niveles de entrada y salida del ensayo de cTnI para el diagnóstico de pacientes con infarto agudo de miocardio están en el rango picomolar bajo27. Debido a que el límite de detección (LOD) de nuestra plataforma de sensores es de aproximadamente 0,1 × Kd de la afinidad de destino de cierre (KLT), buscamos mejorar la sensibilidad de lucCageTrop627 aumentando la afinidad de unión de cTnI. Fusionamos cTnC con el extremo C del sensor para aprovechar la interacción de alta afinidad entre las tres troponinas cardíacas (Datos extendidos Fig. 6b-d). El sensor resultante, lucCageTrop, tiene un LOD picomolar de un solo dígito que es adecuado para la cuantificación de muestras clínicas (Fig. 3b, Datos extendidos Fig. 6e, f).

a, Diseño del sensor cTnI. Izquierda, estructura de la troponina cardíaca (código PDB 4Y99). cTnT, cTnC y cTnI se muestran en cian, verde y magenta, respectivamente. Derecha, modelo de diseño de lucCageTrop. b, Izquierda, la señal de luminiscencia aumenta después de la adición de 1 nM de cTnI a 0,1 nM de lucCageTrop más lucKey. Derecha, amplio rango de detección accesible cambiando la concentración de los componentes del sensor (líneas de colores). El área gris indica el rango de concentración de cTnI relevante para el diagnóstico de infarto agudo de miocardio27; la línea de puntos indica el límite clínico para el infarto agudo de miocardio definido por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (0,6 ng ml−1, 25 pM). c, modelos de diseño de sensor HBV (dorado, SmBiT; gris, enlazador; magenta, epítopo preS1 de HBV). d, lucCageHBVα con dos copias de epítopo tiene mayor afinidad por interferometría de biocapa por el anticuerpo anti-VHB HzKR127-3.2 (Kd = 0,68 nM) que lucCageHBV (Kd = 20 nM). e, Izquierda, la señal de luminiscencia aumenta después de la adición de anticuerpo anti-VHB 50 nM a lucCageHBVα 1 nM más lucKey. Detección de anticuerpos anti-VHB correcta y sensible en un amplio rango de concentración. f, Mecanismo para la detección de preS1 utilizando lucCageHBV. g, Cinética de la bioluminiscencia después de la adición del anticuerpo anti-VHB ('1') y posteriormente preS1 ('2'), que disminuye la bioluminiscencia al competir con el sensor por el anticuerpo. h, la detección de preS1 se puede lograr sobre los niveles de concentración relevantes posteriores a la infección por VHB (área gris) variando la concentración de anticuerpo (indicada por etiquetas de colores). Todos los experimentos se realizaron por triplicado, se muestran datos representativos y los datos son la media ± sd

La detección de anticuerpos específicos es importante para monitorear la propagación de un patógeno en una población28, el éxito de la vacunación29 y los niveles de anticuerpos terapéuticos9. Para adaptar nuestro sistema para análisis de anticuerpos serológicos, buscamos incorporar epítopos lineales reconocidos por los anticuerpos de interés en lucCage. Primero desarrollamos un sensor para anticuerpos contra el dominio preS1 de la proteína de superficie L30 del virus de la hepatitis B (VHB). El mejor de los ocho diseños probados, denominado 'lucCageHBV', tuvo un aumento de aproximadamente el 150 % en la actividad de la luciferasa después de agregar el anticuerpo anti-HBV HzKR127-3.231 (datos extendidos Fig. 7a–d). Para mejorar aún más el rango dinámico y el LOD de lucCageHBV (datos extendidos Fig. 7e), introdujimos una segunda copia del péptido al final del pestillo para aumentar la afinidad del pestillo con el anticuerpo bivalente (KLT) (Fig. 3c, d) . El diseño resultante, denominado 'lucCageHBVα', tenía un LOD de 260 pM y un rango dinámico del 225 % (Fig. 3e, datos extendidos Fig. 7g–i), con una intensidad de luminiscencia fácilmente detectable con una cámara (datos extendidos Fig. 7j). Debido a que las concentraciones de la mayoría de los anticuerpos terapéuticos en el suero están en el rango micromolar a nanomolar bajo9, esta plataforma debería ser útil para monitorear las concentraciones de anticuerpos terapéuticos en circulación32.

A continuación, buscamos utilizar el sensor lucCageHBV para detectar el antígeno de superficie del VHB. Debido a que nuestros sensores están bajo control termodinámico, planteamos la hipótesis de que el complejo sensor-anticuerpo preensamblado se volvería a equilibrar en presencia de la proteína preS1 del antígeno de superficie del VHB objetivo, con la redistribución del anticuerpo para unirse a la preS1 libre en lugar del epítopo en lucCageHBV (Fig. .3f). La luminiscencia de la mezcla lucCageHBV más HzKR127-3.2 disminuyó poco después de la adición del dominio preS1 (Fig. 3g); la sensibilidad de esta lectura permitió la cuantificación de la concentración de preS1 en el rango clínicamente relevante33 (Fig. 3h, Datos extendidos Fig. 7f).

La pandemia de COVID-19 ha creado una necesidad urgente de herramientas de diagnóstico tanto para el virus SARS-CoV-2 como para los anticuerpos antivirales3. Para diseñar sensores para anticuerpos anti-SARS-CoV-2, primero identificamos en la literatura epítopos lineales altamente inmunogénicos en los proteomas de SARS-CoV34,35 y SARS-CoV-236 que no están presentes en las cepas "comunes" de Coronaviridae. Entre estos, nos enfocamos en dos epítopos en las proteínas de membrana (M) y nucleocápside (N) que son reconocidos por sueros de pacientes con SARS y COVID-1935,36 y para los cuales los anticuerpos derivados de animales de reacción cruzada están disponibles comercialmente (Métodos ). Diseñamos sensores para cada epítopo e identificamos diseños que respondían específicamente a anticuerpos anti-membrana y anti-nucleocápside (Datos extendidos Fig. 8a, b). Estos sensores alcanzaron la señal completa en 2 a 5 minutos y tenían un rango dinámico de aproximadamente 50 a 70 % en respuesta a cantidades nanomolares bajas de anticuerpos (Fig. 4a, b, Datos extendidos, Fig. 8c, d).

a, Izquierda, el sensor lucCageSARS2-M incorpora dos copias del epítopo de la proteína de membrana 1–17 del SARS-CoV-2 (rojo) conectadas con un espaciador flexible. Medio, cinética de la activación de la luminiscencia de lucCageSARS2-M más lucKey 50 nM después de la adición de anticuerpos policlonales de conejo (pAb) anti-SARS-CoV-1-M 100 nM que reaccionan de forma cruzada con los residuos 1–17 del SARS-CoV- 2 proteínas de membrana. Derecha, respuesta de lucCageSARS2-M 5 nM más lucKey a concentraciones variables del anticuerpo policlonal anti-M diana. b, Izquierda, lucCageSARS2-N incorpora dos copias del epítopo 369–382 de la proteína de la nucleocápsida del SARS-CoV-2 (azul claro). Medio, cinética de la activación de la luminiscencia de lucCageSARS2-N más lucKey 50 nM después de la adición de anticuerpo monoclonal de ratón anti-SARS-CoV-1-N 100 nM (clon 18F629.1) que reconoce el epítopo. Derecha, respuesta de lucCageSARS2-N 50 nM más lucKey a una concentración variable de anticuerpo monoclonal anti-N. c, Izquierda, lucCageRBD incorpora un aglutinante4 de SARS-CoV-2 RBD de novo (LCB1, magenta). Medio, las intensidades de luminiscencia aumentan después de la adición de 16,7 nM de SARS-CoV-2 RBD o proteína de punta trimérica a una mezcla de 1 nM de lucCageRBD más lucKey. A la derecha, detección en un rango de concentraciones de analito en tampón, matriz nasal sintética al 10 %38 o suero al 10 %. d, especificidad del biosensor. Cada sensor a 1 nM se incubó con 50 nM de su objetivo afín (líneas magenta) y los objetivos de los otros biosensores (líneas grises). Los objetivos son BCL-2, BoNT/B, IgG Fc humana, HER2, cTnI, anticuerpo anti-HBV (HzKR127-3.2), anticuerpo policlonal anti-SARS-CoV-1-M y SARS-CoV-2 RBD. Todos los experimentos se realizaron por triplicado, se muestran datos representativos y los datos son la media ± sd

Para crear sensores que puedan detectar partículas virales del SARS-CoV-2 directamente, integramos un aglutinante de afinidad picomolar diseñado de novo al dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína del pico del SARS-CoV-2 denominada LCB14 en el formato lucCage (Fig. 4c). De los 13 candidatos probados, el mejor, al que nos referimos como 'lucCageRBD', pudo detectar tanto el RBD monomérico como la proteína espiga trimérica completa del SARS-CoV237 con un LOD de 15 pM y 47 pM, respectivamente, y un rango dinámico de más del 1700 % para la detección RBD (Fig. 4c, datos extendidos Fig. 9). Aumentamos aún más el rango dinámico de lucCageRBD al 5300 % ajustando la afinidad jaula-clave (KCK) mediante el acortamiento de lucKey (datos extendidos, Fig. 10a-c). Además de la detección de virus, el sensor RBD también podría usarse para monitorear la generación de anticuerpos en respuesta a la vacunación utilizando un formato de competencia análogo al descrito anteriormente para la detección de anticuerpos contra el VHB (Fig. 3f): la capacidad de cuantificar las respuestas en un amplio El rango dinámico y distinguir los anticuerpos neutralizantes que se unen en el sitio de unión de ACE2 en el RBD (y, por lo tanto, compiten con LCB1 en el sensor) de los anticuerpos no neutralizantes que se unen en otros lugares son ventajas potenciales sobre los ensayos de flujo lateral.

Para evaluar la capacidad de nuestra plataforma de sensores para funcionar en matrices biológicas complejas, comparamos la detección de RBD por lucCageRBD en tampón, matriz nasal simulada38 y suero humano, y observamos solo una reducción menor en las dos últimas condiciones (Fig. 4c). Siguiendo una sugerencia de M. Merkx39, controlamos la variación en la señal de luminiscencia absoluta en muestras de suero enriquecidas de cuatro donantes diferentes y matriz nasal simulada enriquecida utilizando una referencia BRET40 para la calibración interna, y descubrimos que con dicha calibración, el RBD podría cuantificarse con precisión sin comprometer el rango dinámico del sensor (Datos extendidos Fig. 11). Estos resultados sugieren que el sistema lucCage podría usarse en dispositivos de diagnóstico en el punto de atención.

Para probar la especificidad de los biosensores diseñados, medimos la cinética de activación de cada lucCage en respuesta a cada uno de los objetivos uno a la vez. Cada sensor respondió rápida y sensiblemente a su objetivo afín, pero no a ninguno de los otros (Fig. 4d). En su mayor parte, los sensores reales (Tablas complementarias 2, 3) funcionaron según lo predicho por el modelo termodinámico simple; por ejemplo, los experimentos con diferentes concentraciones de sensores y claves sugieren poco acoplamiento entre los parámetros. Sin embargo, existe una variación considerable entre diferentes sensores en el nivel de activación a concentraciones objetivo saturadas o concentraciones altas de lucKey, que para la mayoría es más baja que la esperada para la reconstitución completa de luciferasa predicha por el modelo (Datos extendidos Fig. 10d-g, Suplementario Tabla 4). Esto puede ser una consecuencia de la interferencia estérica entre la unión del objetivo al pestillo y la reconstitución de la luciferasa, ya que el motivo de unión al objetivo y la luciferasa SmBiT son adyacentes entre sí en el pestillo; dicha interferencia podría resolverse aumentando la separación entre los dos en el interruptor. El potencial del sistema lucCage se ilustra con el alto rango dinámico (5300 %) y la sensibilidad picomolar del sensor lucCageRBD: el valor de Kopen casi óptimo da como resultado un fondo muy bajo en ausencia del objetivo sin comprometer el alcance de la activación en el objetivo bajo concentraciones

Es instructivo poner nuestros sensores en el contexto de las muchas plataformas de biosensores basadas en proteínas que se han desarrollado a lo largo de los años con un éxito considerable (Discusión complementaria, Tabla complementaria 5). Nuestra plataforma de sensores se basa en el acoplamiento termodinámico entre los estados cerrado y abierto definidos del sistema y, por lo tanto, su sensibilidad depende del cambio de energía libre que se produce después de que el dominio de detección se une al objetivo, pero no de la geometría específica de la interacción de unión ( los sensores semisintéticos de moléculas pequeñas10,11 también tienen esta propiedad). Esto permite la incorporación de varias modalidades de unión, incluidos péptidos pequeños, miniproteínas globulares, epítopos de anticuerpos y aglutinantes diseñados de novo, para generar sensores sensibles para una amplia gama de objetivos proteicos con poca o ninguna optimización. Para aplicaciones de punto de atención, nuestro sistema, similar a otras plataformas de biosensores de proteínas basadas en bioluminiscencia8, tiene las ventajas de ser homogéneo, sin lavado y una lectura casi instantánea; la cuantificación de la luminiscencia se puede realizar con dispositivos económicos y accesibles como la cámara de un teléfono móvil8. En entornos hospitalarios, la capacidad de diseñar modularmente sensores con lecturas idénticas para diversos objetivos podría permitir la lectura rápida de una gran cantidad de compuestos diferentes utilizando una matriz de cientos de sensores diferentes.

Hasta hace poco, el enfoque del diseño de proteínas de novo era el diseño de proteínas con nuevas estructuras que corresponden a mínimos únicos de energía libre profunda; nuestros resultados destacan el progreso en el campo que ahora permite generar fácilmente sistemas multiestado más complejos. Al igual que otras proteínas diseñadas de novo, nuestros sensores se expresan en niveles elevados en las células y son muy estables41, lo que debería facilitar considerablemente su fabricación y distribución. Como se destaca por el excelente rendimiento del sensor lucCageRBD, existe una fuerte sinergia entre la arquitectura general de "dispositivo molecular" de nuestra plataforma y los aglutinantes de miniproteínas de alta afinidad diseñados de novo4,21 (estas miniproteínas de novo también son efectivas con otras plataformas42). A medida que el poder del diseño computacional continúa aumentando, debería ser posible detectar una gama cada vez más amplia de objetivos con mayor sensibilidad utilizando sensores lucCage. Más allá de los biosensores, nuestros resultados destacan el potencial del diseño de proteínas de novo para crear soluciones más generales para los desafíos actuales que las que se pueden lograr mediante la reutilización de proteínas nativas que han evolucionado para resolver desafíos completamente diferentes.

El SmBiT 114 de baja afinidad (VTGYRLFEEIL) 18 se injertó en el pestillo del interruptor LOCKR asimétrico descrito anteriormente 2 utilizando GraftSwitchMover, un algoritmo de diseño de proteínas basado en RosettaScripts (consulte Métodos complementarios para obtener más detalles). El rango de muestreo del injerto se asignó entre los residuos 300 y 330. Los diseños resultantes se minimizaron en energía, se inspeccionaron visualmente y se seleccionaron para la síntesis de genes, la producción de proteínas y los análisis bioquímicos posteriores. Se determinó experimentalmente que la mejor posición de SmBit en el pestillo era una inserción en el residuo 312, como se describe en Datos ampliados, Fig. 2. Este diseño se denominó lucCage. lucKey se ensambló fusionando genéticamente el LgBit de NanoLuc18 con el péptido clave descrito anteriormente2. Todas las secuencias de proteínas se enumeran en la Tabla complementaria 6.

Para péptidos y epítopos, la secuencia de aminoácidos para cada dominio de detección se injertó usando Rosettascripts43 GraftSwitchMover en todos los registros α-helicoidales entre los residuos 325 y 359 de lucCage. En los casos en los que la secuencia deseada para insertar superó la longitud del pestillo de lucCage, utilizamos Rosetta Remodel44 para modelar la extensión del extremo C de lucCage (consulte Métodos complementarios para obtener más detalles). Se minimizó la energía de los lucCages resultantes utilizando Rosetta fast relax45, se inspeccionaron visualmente y, por lo general, se seleccionaron menos de diez diseños para la posterior producción de proteínas y caracterización bioquímica.

Para los dominios de proteínas, se identificó el segmento del elemento de la estructura secundaria principal que forma la interfaz del dominio de la proteína de unión con el objetivo. La secuencia de aminoácidos se extrajo y se injertó en lucCage utilizando GraftSwitchMover o Rosetta Remodel como se describe anteriormente. Luego, usamos MergePDBMover y Pymol 2.0 para alinear, modelar y visualizar el dominio de enlace de longitud completa en el contexto del cambio (consulte Métodos complementarios para obtener más detalles). Los diseños se minimizaron en energía utilizando Rosetta Fast Relax y se inspeccionaron visualmente para su selección.

Las secuencias de proteínas diseñadas se optimizaron por codones para la expresión de E. coli y se ordenaron como genes sintéticos en vectores de expresión de E. coli pET21b+ o pET29b+. El gen sintético se insertó en los sitios NdeI y XhoI de cada vector, incluida una etiqueta de hexahistidina N-terminal seguida de un sitio de escisión de proteasa TEV y se añadió un codón de parada en el extremo C terminal.

La cepa E. coli Lemo21(DE3) (NEB) se transformó con un plásmido pET21b+ o pET29b+ que codifica el gen de interés sintetizado. Las células se cultivaron durante 24 h en medio LB suplementado con carbenicilina o kanamicina. Las células se inocularon en una proporción de 1:50 ml en el medio de autoinducción Studier TBM-5052 complementado con carbenicilina o kanamicina, se cultivaron a 37 °C durante 2 a 4 h y luego se cultivaron a 18 °C durante 18 h adicionales. Las células se recogieron por centrifugación a 4000 g a 4 °C durante 15 min y se resuspendieron en 30 ml de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 30 mM imidazol, 1 mM PMSF, 0,02 mg ml−1 DNasa) . Las resuspensiones celulares se lisaron mediante sonicación durante 2,5 min (ciclos de 5 s). Los lisados ​​se aclararon mediante centrifugación a 24 000 g a 4 °C durante 20 min y se pasaron a través de 2 ml de resina de níquel Ni-NTA (Qiagen, 30250) preequilibrada con tampón de lavado (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, imidazol 30 mM). La resina se lavó dos veces con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de lavado y luego se eluyó con 3 CV de tampón de elución (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM). Las proteínas eluidas se concentraron usando unidades de filtro centrífugo Ultra-15 (Amicon) y se purificaron más usando una columna de exclusión por tamaño Superdex 75 Increment 10/300 GL (GE Healthcare) en TBS (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) . Las fracciones que contenían proteína monomérica se agruparon, concentraron y congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Se utilizó un lector de microplacas Synergy Neo2 (BioTek) para todas las mediciones de bioluminiscencia in vitro. Los ensayos se realizaron en DPBS al 50 % con calcio (Gibco) más tampón de ensayo Nano-Glo al 50 % (Promega) para sensores cTnI y HBS-EP al 50 % (GE Healthcare Life Sciences) más tampón de ensayo Nano-Glo al 50 % para otros sensores Primero se prepararon 10x lucCage, 10x lucKey y 10x proteínas diana de las concentraciones deseadas a partir de soluciones madre. Para cada pocillo de una placa blanca opaca de 96 pocillos, se mezclaron 10 μl de 10x lucCage, 10 μl de 10x lucKey y 20 μl de tampón para alcanzar la concentración y proporción indicadas. Los componentes lucCage y lucKey se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente para permitir el preequilibrio. La placa se centrifugó a 1000 g durante 1 min y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min más. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 μl de furimazina diluida 50x (reactivo de ensayo de luciferasa Nano-Glo, Promega). Para los ensayos que contenían suero o matriz nasal simulada (NaCl 110 mM, mucina al 1 % (p/v), 10 μg ml−1 de ADN genómico humano38), la composición del tampón se reemplazó por la matriz biológica. Se tomaron medidas de bioluminiscencia en ausencia del objetivo cada 1 min después de la inyección (0,1 s de integración y 10 s de agitación durante los intervalos). Después de alrededor de 15 min, se inyectaron 10 μl de proteína diana 10x diluida en serie más un blanco y la adquisición cinética de bioluminiscencia continuó durante un total de 2 h. Para derivar los valores de concentración efectiva media máxima (EC50) de la gráfica de bioluminiscencia a analito, se promediaron las tres intensidades máximas de bioluminiscencia en concentraciones de analito individuales, se restaron del blanco y se usaron para ajustar la curva 4PL sigmoidal. Para calcular el LOD, se extrajo la región lineal de las respuestas de bioluminiscencia de los sensores a su analito y se obtuvo una curva de regresión lineal. Se utilizó para derivar la desviación estándar de la respuesta y la pendiente de la curva de calibración (S). El LOD se determinó como: 3 × (sd/S).

Las muestras de suero se derivaron del exceso de plasma o sueros de adultos (>18 años) de ambos sexos proporcionados por el Director de la División de Química Clínica del hospital de la Universidad de Washington. Todos los especímenes de donantes anonimizados se proporcionaron anonimizados. Debido a que los donantes dieron su consentimiento para que el exceso de especímenes se utilizara para otros estudios experimentales, podrían transferirse a nuestro estudio sin consentimiento adicional. Todas las muestras se pasaron a través de filtros de 0,22 μm antes de su uso. Diez microlitros de RBD monomérico diluido en serie 10x (167-0,69 nM), 5 l de lucCage 20x (20 nM), 5 l de lucKey 20x (20 nM), 5 l de Antares2 20x (2 nM) y Se mezclaron 10, 20, 25 o 50 μl de suero de donante humano o matriz nasal simulada con tampón de ensayo HBS:Nano-Glo 1:1 para alcanzar un volumen total de 75 μl. La placa se centrifugó a 1.000 g durante 1 min. A continuación, se añadieron a cada pocillo 25 μl de furimazina diluida 25X en tampón. Las señales de bioluminiscencia se registraron desde los canales de 470/40 nm y 590/35 nm cada 1 min durante un total de 1 h. La relación en cada punto de tiempo se calculó mediante la ecuación descrita en Datos extendidos Fig. 11b. El SARS-CoV-2 RBD monomérico se expresó y purificó como se describió anteriormente46.

Las interacciones proteína-proteína se midieron utilizando un sistema Octet RED96 (ForteBio) utilizando biosensores recubiertos con estreptavidina (ForteBio). Cada pocillo contenía 200 μl de solución y el tampón de ensayo era tampón HBS-EP+ (GE Healthcare Life Sciences, 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % (v/v) de surfactante P20) más 0,5 % Bloqueador de grado de transferencia de leche en polvo sin grasa (BioRad). Las puntas del biosensor se cargaron con péptido o proteína analito a 20 μg ml−1 durante 300 s (umbral de respuesta de 0,5 nm), se incubaron en tampón HBS-EP+ durante 60 s para adquirir la medición de referencia, se sumergieron en la solución que contenía la jaula y/ o tecla durante 600 s (paso de asociación) y sumergida en el tampón HBS-EP+ durante 600 s (pasos de disociación). Los datos de unión se analizaron con el software de análisis de datos ForteBio versión 9.0.0.10.

La secuencia del péptido BIM (EIWIAQELRRIGDEFNAYYA) se insertó en el andamio de lucCage como se describe en 'Injerto computacional de dominios de detección en lucCage'. Los diseños seleccionados se expresaron en E. coli, se purificaron y caracterizaron para activación de luminiscencia. La señal de detección de bioluminiscencia se midió para cada lucCage de diseño a 20 nM mezclado con lucKey a 20 nM, en presencia o ausencia de la proteína BCL-2 diana a 200 nM. El BCL-2 recombinante se produjo como se describió previamente47.

Los principales motivos de unión del aglutinante de novo Bot.0671.2, el dominio C de la proteína A de Staphylococcus aureus (SpaC), el anticuerpo HER2 y el aglutinante LCB1 de RBD de novo se insertaron en lucCage como se describe en 'Injerto computacional de dominios de detección en lucCage' ( consulte las Tablas complementarias 3 y 6 para conocer las secuencias). Los diseños seleccionados se expresaron en E. coli, se purificaron y caracterizaron para activación de luminiscencia. Los diseños se seleccionaron midiendo la señal de bioluminiscencia para cada diseño lucCage a 20 nM mezclado con lucKey a 20 nM, en presencia o ausencia de proteína diana 200 nM. Las proteínas diana utilizadas fueron: neurotoxina botulínica B HcB expresada como se ha descrito anteriormente48, IgG1 Fc-HisTag humana (AcroBiosystems, IG1-H5225) y HER2-HisTag humana (AcroBiosystems, HE2-H5225). El SARS-CoV-2 RBD monomérico y la proteína espiga trimérica del SARS-CoV-2 (versión Hexapro preestabilizada37) se expresaron y purificaron como se describió anteriormente46.

La secuencia del motivo de unión a cTnT se truncó en fragmentos de diferente longitud (Datos ampliados, Fig. 6) y se insertó en el andamio de lucCage como se describe en 'Injerto computacional de dominios de detección en lucCage'. Los diseños seleccionados se expresaron en E. coli, se purificaron y caracterizaron para activación de luminiscencia. Los diseños se cribaron midiendo la señal de bioluminiscencia para cada diseño lucCage a 20 nM mezclado con lucKey a 20 nM en presencia o ausencia de cTnI 100 nM (Genscript, Z03320-50). Posteriormente, se creó lucCageTrop, una versión mejorada por fusión con cTnC, fusionando genéticamente la siguiente secuencia con el extremo C de lucCageTrop627.

El motivo de unión (GANSNNPDWDFN) del dominio preS1 se insertó en el andamio lucCage en cada posición después de los residuos 336 utilizando Rosetta GraftSwitchMover. Siguiendo el protocolo Rosetta FastRelax, se seleccionaron ocho diseños para la producción de proteínas. Los diseños se seleccionaron midiendo la señal de bioluminiscencia para cada diseño lucCage (20 nM) y lucKey (20 nM) en presencia o ausencia del anticuerpo anti-HVB HzKR127-3.2 (100 nM) para seleccionar lucCageHBV. Posteriormente, se construyó lucCageHBVα mediante la fusión genética de una secuencia que contenía un segundo motivo antigénico (GGSGGGSSGFGANSNNPDWDFNPN) con lucCageHBV.

Los epítopos antigénicos de la proteína de membrana del SARS-CoV-2 (aminoácidos 1–31, 1–17 y 8–24) y la proteína de la nucleocápside (aminoácidos 368–388 y 369–382) se injertaron computacionalmente en lucCage como se describe en ' Injerto computacional de dominios de detección en lucCage'. Los diseños seleccionados se expresaron en E. coli, se purificaron y caracterizaron para activación de luminiscencia. Todos los diseños a 50 nM se mezclaron con lucKey 50 nM y se analizaron experimentalmente para detectar un aumento de la luminiscencia en presencia de anticuerpos policlonales de membrana anti-SARS-CoV de conejo (ProSci, 3527) a 100 nM o anticuerpos monoclonales de nucleocápsida anti-SARS-CoV de ratón (clon 18F629.1, NovusBio NBP2-24745) a 100 nM.

HB1.9549.2 se incrustó en el paquete de seis hélices original para el diseño de sCage en diferentes posiciones a lo largo de la hélice de cierre del andamio. Para promover interacciones intramoleculares más favorables, se sustituyeron intencionalmente tres residuos consecutivos en el pestillo con glicina para permitir la libertad conformacional. Los cinco diseños se produjeron en E. coli. El análisis de interferometría de biocapa se realizó con jaulas purificadas (1 μM) y influenza A H1 HA21 biotinilada cargada en puntas de biosensor recubiertas de estreptavidina (ForteBio) en presencia o ausencia de la clave (2 μM) utilizando un instrumento Octet (ForteBio).

Los fragmentos de ADN de VH y VL sintéticos se subclonaron en el plásmido pdCMV-dhfrC-cA10A3 que contenía las secuencias de ADN de Cγ1 y Cγ humanas. El vector se introdujo en células HEK 293F usando Lipofectamine (Invitrogen), y las células se cultivaron en FreeStyle 293 (GIBCO) en CO2 al 5 % en una incubadora humidificada a 37 °C. El sobrenadante del cultivo se cargó en una columna de proteína A-Sepharose (Millipore) y el anticuerpo unido se eluyó mediante la adición de glicina-HCl 0,2 M (pH 2,7), seguido de una neutralización inmediata con Tris-HCl 1 M (pH 8,0) . La solución se dializó frente a HEPES-NaOH 10 mM (pH 7,4) y la pureza de la proteína se analizó mediante SDS-PAGE.

El fragmento de ADN que codifica el dominio preS1 (residuos 1–56) se clonó en el plásmido pGEX-2T (GE Healthcare) y la proteína se produjo en la cepa (NEB) de E. coli BL21(DE3) a 18 °C como proteína de fusión con glutatión-S-transferasa (GST) en el extremo N. Los lisados ​​celulares se prepararon en una solución tampón (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM), y el sobrenadante clarificado se cargó en GSTBind Resin (Novagen). El dominio GST-preS1 se eluyó con el mismo tampón que contenía glutatión reducido 10 mM adicional, se purificó aún más usando una columna de exclusión por tamaño Superdex 75 Increment 10/300 GL (GE Healthcare) y se concentró a 34 μM.

sCageHA_267-1S y sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y) se expresaron a 18 °C en la cepa (NEB) de E. coli LEMO21(DE3) como una proteína de fusión que contiene un dominio de cisteína proteasa (CPD) etiquetado con (His)10 derivado de Vibrio cholerae49 en el extremo C. La proteína se purificó usando resina de níquel HisPur (Thermo), una columna de intercambio aniónico HiTrap Q (GE Healthcare) y una columna de filtración de gel HiLoad 26/60 Superdex 75 (GE Healthcare). Para el marcaje con selenometionina (SelMet), se introdujo adicionalmente una mutación I30M para generar una variante sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y/I30M). Esta proteína se expresó en la cepa E. coli B834 (DE3) RIL (Novagen) en el medio mínimo que contenía SeMet, y se purificó según el mismo procedimiento de purificación de las otras variantes.

Se introdujeron dos mutaciones puntuales (Glu99Tyr y Thr144Tyr) en un intento de inducir interacciones de empaquetamiento de cristales favorables. Se obtuvieron monocristales de sCageHA_267-1S(E99Y/T144Y/I30M) de buena calidad en un entorno de difusión de vapor de gota colgante mediante microsiembra en una solución que contenía etanol al 11 % (v/v), NaCl 0,25 M, NaCl 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5). Los cristales requerían un estricto mantenimiento de la temperatura a 25 °C. Para la crioprotección, los cristales se sumergieron brevemente en la solución de cristalización suplementada con 2,3-butanodiol al 15 % y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido. Se recopiló un conjunto de datos de dispersión anómala de longitud de onda única en el pico de absorción de Se y se procesó con HKL200050. Las posiciones de Se y el mapa de densidad de electrones inicial se calcularon utilizando el módulo AutoSol en PHENIX51. La construcción del modelo y el refinamiento de la estructura se realizaron utilizando COOT52 y PHENIX.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyó ninguna muestra del análisis de datos y no se utilizó cegamiento. Las muestras clínicas de suero no identificadas se usaron aleatoriamente para añadir proteínas diana. Los resultados se reprodujeron con éxito usando diferentes lotes de proteínas puras en días diferentes. A menos que se indique lo contrario, los datos se muestran como media ± sd, y las barras de error en las cifras representan sd del triplicado técnico. Los datos de interferometría de la biocapa se analizaron utilizando el software de análisis de datos ForteBio versión 9.0.0.10. Todos los datos se analizaron y graficaron usando GraphPad Prism 8.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este documento.

Las coordenadas atómicas de sCageHA_267-1S se han depositado en el PDB con el código de acceso 7CBC. Los datos experimentales originales que respaldan los hallazgos de este trabajo están disponibles a los autores correspondientes previa solicitud. Los plásmidos que codifican las proteínas biosensoras descritas en este artículo están disponibles a pedido de los autores correspondientes.

Los modelos de diseño y el código RosettaScripts utilizados en el manuscrito se han depositado en http://files.ipd.uw.edu/pub/de_novo_design_of_tunable_biosensors_2021/designcode_and_models.zip. El código para las simulaciones numéricas que se muestran en este manuscrito están disponibles en http://files.ipd.uw.edu/pub/de_novo_design_of_tunable_biosensors_2021/model_simulation.py

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Reconocemos la financiación del HHMI (DB), la Fundación LG Yonam (B.-HO), el proyecto BK21 PLUS de Corea (HL), la Red de Investigación Antiviral del Mundo Unido (UWARN), uno de los Centros de Investigación de Enfermedades Infecciosas Emergentes 'CREID' , NIAID 1 U01 AI151698-01 (DB, LS y H-.WY), The Audacious Project at the Institute for Protein Design (DB, H-.WY, CMC and MCM), Eric y Wendy Schmidt por recomendación de Schmidt Futures (AQ-.R. y H-.WY), Washington Research Foundation (JP y MJL), Nordstrom Barrier Institute for Protein Design Directors Fund (RAL), The Open Philanthropy Project Improving Protein Design Fund (DB y SEB), el apoyo donativo de Gree Real Estate (AQ-R.), Fundación 'la Caixa' (AQ-R., ID 100010434 bajo subvención LCF/BQ/AN15/10380003), apoyo 1U19AG065156-01 (DB), y Oficina del Ejército del Aire de Investigación Científica FA9550-18-1-0297 (DB). Agradecemos a M. Wener por recolectar muestras de suero humano anonimizadas, a WC Van Voorhis por su asesoramiento y apoyo con los sensores de anticuerpos anti-SARS-CoV-2, a N. Panpradist y B. Lutz por proporcionar una matriz nasal simulada, a S. Berger por compartiendo el objetivo de la proteína BCL-2, DA Silva Manzano por proporcionar la neurotoxina botulínica B, A. Kang por configurar bandejas de cristal de detección, y L. Carter, B. Fiala y el Instituto de Diseño de Proteínas por proporcionar SARS-CoV-2 RBD y proteína espiga. Agradecemos a M. Merkx por sugerir la referencia interna de BRET para controlar las fluctuaciones de muestra a muestra en la actividad de la luciferasa. Los datos de rayos X se recopilaron en Beamline 5C en el Laboratorio Acelerador de Pohang, Corea. Todas las estructuras de proteínas y las imágenes del modelo se generaron utilizando PyMOL 2.0.

Parque Jooyoung

Dirección actual: Sana Biotechnology, Inc, Seattle, WA, EE. UU.

Robert A. Langan, Scott E. Boyken y Marc J. Lajoie

Dirección actual: Outpace Bio, Inc., Seattle, WA, EE. UU.

Los siguientes autores contribuyeron por igual: Alfredo Quijano-Rubio, Hsien-Wei Yeh

Departamento de Bioquímica, Instituto para el Diseño de Proteínas, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Alfredo Quijano-Rubio, Hsien-Wei Yeh, Jooyoung Park, Robert A. Langan, Scott E. Boyken, Marc J. Lajoie, Longxing Cao, Cameron M. Chow, Mark C. Miranda, Lance Stewart, Byung-Ha Oh y David Panadero

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Alfredo Quijano-Rubio

Departamento de Ciencias Biológicas, Instituto KAIST para el Biosiglo, Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea, Daejeon, Corea del Sur

Hansol Lee y Byung-Ha Oh

Departamento de Inmunología de Sistemas, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional de Kangwon, Chuncheon, Corea del Sur

Jimin Wi y Hyo Jeong Hong

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

david panadero

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DB dirigió el trabajo. DB, AQ-R., H.-WY, B.-HO, JP y LS diseñaron y conceptualizaron aún más la investigación. AQ-R., JP, B.-HO y H.-WY realizaron el diseño computacional de los sensores. AQ-R., JP y B.-HO exploraron los primeros diseños de sensores. H.-WY y AQ-R. optimizó el diseño de sensores para mejorar el rendimiento y realizó las caracterizaciones experimentales. H.-WY y AQ-R. realizó la validación experimental. BHO dirigió y HL realizó el trabajo cristalográfico. H.-WY y RAL escribieron el modelo termodinámico y realizaron las simulaciones. RAL escribió GraftSwitchMover. SEB y MJL diseñaron la jaula parental y los andamios de proteínas clave. LC diseñó el encuadernador RBD LCB1. CMC, MCM, JW y HJH realizaron la purificación de proteínas. DB, B.-HO, AQ-R. y H.-WY escribieron el borrador original. Todos los autores revisaron y aceptaron el manuscrito.

Correspondencia a Byung-Ha Oh o David Baker.

DB, AQ-R., H.-WY y JP son coinventores en una solicitud de patente provisional (número de solicitud 63/030,836 presentada por la Universidad de Washington) que cubre los biosensores descritos en este artículo. DB, AQ-R., H.-WY, LC y LS son coinventores en una solicitud de patente provisional (número de solicitud 63/051549 presentada por la Universidad de Washington) que cubre el biosensor SARS-CoV-2 RBD descrito en este artículo . El resto de los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Información sobre la revisión por pares Nature agradece a Caryn Bern, Vincent Hilser y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a–e, Simulaciones numéricas de los equilibrios acoplados que se muestran en la Fig. 1b para diferentes valores de Kopen (a), KLT (b), [lucKey]tot (c), [lucCage]tot (d) y Kopen (e). A menos que se indique lo contrario, las simulaciones se realizaron con valores fijos para Kopen = 1 × 10−3 M, KLT = 10−9 M y KCK = 10−8 M, y la concentración de los componentes del sensor a 10:100 nM ([ lucCage]tot:[lucKey]tot). a, el aumento de ΔGopen (Kopen más pequeño) cambia la respuesta del sensor a concentraciones de analito más altas. b, el LOD del sensor es de aproximadamente 0,1 × KLT; la fuerza impulsora para abrir el interruptor se vuelve demasiado débil por debajo de esta concentración. c, d, El rango efectivo de detección de objetivos se puede ajustar cambiando las concentraciones de los dos componentes del sensor. Los resultados de la simulación que se muestran en una escala logarítmica (c) o una escala lineal (d) para la concentración del objetivo ilustran que la inclinación de la respuesta depende de la relación entre la concentración del sensor y la interacción de unión entre el pestillo y el objetivo (KLT). e, los valores de KCK afectan a ambas especies responsables del fondo y la señal (especies 6 y 7 en la Fig. 1b, respectivamente), lo que lleva a diferentes rangos dinámicos del sensor. f, g, Simulaciones con varios valores de Kopen y KCK. La formación de la especie 6 (en la Fig. 1b) aumenta con los grandes valores de Kopen y las fuertes interacciones lucCage-lucKey (KCK). f, Un mapa de calor que representa el rango dinámico del sensor calculado según los valores de Kopen y KCK. Kopen ejerce un efecto predominante en el rango dinámico, y KCK proporciona un orden adicional de sintonizabilidad. g, Un mapa de calor que muestra la fracción de luciferasa reconstituida (sensibilidad) a una concentración objetivo de saturación, lo que indica una compensación de ajuste de KCK.

a, Modelos de proteínas que muestran las diferentes posiciones de enhebrado de SmBiT (oro) y el péptido BIM (salmón) en la hélice del pestillo del interruptor LOCKR de novo (azul). b, Detección experimental de 11 sensores BCL-2 de novo. Se generaron once variantes combinando las posiciones SmBiT y BIM en a y caracterizadas por la activación de su luminiscencia después de la adición de BCL-2. Las mediciones de luminiscencia se realizaron con cada diseño (20 nM) y lucKey (20 nM) en presencia o ausencia de BCL-2 (200 nM). Se seleccionó SmBiT312-BIM339 (de ahí lucCageBIM) para la caracterización posterior debido a su mayor brillo, rango dinámico y estabilidad. c–g, Caracterización de lucCageBIM. c, Modelo de diseño estructural en representación de cinta. d, Vista de primer plano que muestra la interfaz prevista de SmBiT (dorado) y la jaula (azul). e, Vista de primer plano que muestra la interfaz prevista de BIM (salmón) y la jaula (azul). f, Mediciones de luminiscencia cinética después de agregar BCL-2 (200 nM) a una mezcla de lucCageBIM (20 nM) y lucKey (20 nM). g, Sensibilidad ajustable de lucCageBIM a BCL-2 cambiando las concentraciones de los componentes del sensor (lucCageBIM y lucKey) (curvas coloreadas).

a, Modelos estructurales de diseños sCageHA con el aglutinante de novo integrado HB1.9549.2. La proteína HB1.9549.2 (cian) se injertó en un paquete parental de seis hélices (sCage, amarillo) en diferentes posiciones a lo largo de la hélice de cierre (magenta), incluidos tres residuos de glicina consecutivos (verde). Las flechas negras indican las mutaciones simples V255S (1S) o dobles V255S/I270S (2S) introducidas adicionalmente en el pestillo. b, Validación experimental de cinco diseños de sCageHA que se unen a HA en presencia o ausencia de la clave mediante interferometría de biocapa. La concentración de las sCages y la clave fue de 1 μM y 2 μM, respectivamente. Cada experimento se realizó una vez. sCageHA_267-1S exhibió el pliegue más alto de activación. c, Comparación estructural que muestra la naturaleza flexible de sCage para permitir el enjaulamiento de HB1.9549.2. El modelo estructural de sCage (gris) y la estructura cristalina de sCageHA_267-1S (dorado) se superponen, y se muestra una sección estrecha (recuadro negro) en una vista ortogonal para obtener detalles. La hélice N-terminal de HB1.9549.2 se desplaza de la hélice del pestillo (α6) en 3,2 Å (centro) con un desplazamiento concomitante de α5 y una interrupción parcial de una red de enlaces de hidrógeno que involucra a Q16 y N214 de sCage (derecha). d, Una vista de primer plano de las interacciones intramoleculares de sCageHA_267-1S. Los residuos de unión a HA están resaltados en magenta. Tanto la hélice N-terminal (cian α1) como la siguiente hélice (cian α2) de HB1.9549.2 interactúan con la jaula. Las interacciones intramoleculares son todas hidrófobas. La voluminosa cadena lateral hidrofóbica de F285 se apoya fuertemente contra los átomos de la columna vertebral de α5 de sCage, lo que es poco probable que suceda sin una flexión de α5. También se encuentran interacciones desfavorables: F273 está expuesto a solventes y el grupo hidroxilo de Y287 está enterrado en el entorno apolar. El panel más a la derecha muestra la calidad del mapa de densidad de electrones.

a, Modelos estructurales de los diseños del sensor BoNT/B que muestran las diferentes posiciones de roscado de Bot.0671.2 (verde, código PDB 5VID) en el pestillo de lucCage (azul). El péptido SmBiT se muestra en representación de cinta dorada. I328S y L345S indican mutaciones introducidas para ajustar la interfaz pestillo-jaula ('1S' denota I328S, '2S' denota I328S/L345S)2, y 'GGG' indica la presencia de tres residuos de glicina consecutivos entre el pestillo y la proteína injertada. El cuadro negro muestra una vista de primer plano de la interfaz de la jaula (azul) y Bot.0671.2 (verde) en el diseño 349_2S. b, Detección experimental de nueve sensores BoNT/B de novo. Se realizaron mediciones de luminiscencia para cada diseño (20 nM) y lucKey (20 nM) en presencia o ausencia de la proteína BoNT/B (200 nM). Los valores de luminiscencia para cada diseño se normalizaron a 100 en ausencia de BoNT/B. El diseño 349_2S fue seleccionado como el mejor candidato debido a su alta sensibilidad y estabilidad, y recibió el nombre de lucCageBot. c, Determinación de la sensibilidad de lucCageBot. La bioluminiscencia se midió durante 6000 s en presencia de proteína BoNT/B diluida en serie. Las concentraciones de lucCageBot:lucKey (en nM) fueron 50:5, 5:5, 1:10 y 0,5:0,5 (de arriba a abajo). d, cálculos de LOD para el sensor a diferentes concentraciones. Las concentraciones de lucCageBot:lucKey (en nM) fueron 50:5, 5:5, 1:10 y 0,5:0,5 (de arriba a abajo). Todos los experimentos se realizaron por triplicado, se muestran datos representativos y los datos son la media ± sd

a, Modelos estructurales de los diseños del sensor Fc que muestran las diferentes posiciones de enhebrado del dominio C de la proteína A de S. aureus (naranja, código PDB 4WWI) en el pestillo de lucCage (azul). El péptido SmBit se muestra en representación de cinta dorada. I328S y L345S indican mutaciones introducidas para ajustar la interfaz pestillo-jaula como en Datos extendidos Fig. 4a. b, Selección experimental de seis sensores de dominio Fc de novo. Se realizaron mediciones de luminiscencia para cada diseño (20 nM) y lucKey (20 nM) en presencia o ausencia de IgG1 Fc humana recombinante (200 nM). Los valores de luminiscencia se normalizaron a 100 en ausencia de Fc. El diseño 351_2S fue seleccionado como el mejor candidato debido a su alta sensibilidad y recibió el nombre de lucCageProA. Este experimento se realizó utilizando réplicas individuales en dos instancias independientes, se muestran datos representativos. c, Determinación de la sensibilidad de lucCageProA. La bioluminiscencia se midió durante 6000 s en presencia de proteína Fc diluida en serie. Las concentraciones de lucCageBot:lucKey (en nM) fueron 5:5 (arriba), 1:10 (medio) y 0,5:0,5 (abajo). d, cálculos de LOD para el sensor a diferentes concentraciones. Las concentraciones de lucCageBot:lucKey (en nM) fueron 5:5 (arriba), 1:10 (medio) y 0,5:0,5 (abajo). e, Modelos estructurales de los diseños del sensor HER2 que muestran las diferentes posiciones de enhebrado de la proteína affibody HER2 (código PDB 3MZW, beige) en el pestillo de lucCage (azul), como en a. Los recuadros negros muestran una vista de primer plano de la interfaz de la jaula (azul) y el affibody HER2 (beige) en el diseño 354_2S. f, Detección experimental de siete sensores HER2 de novo. Se tomaron medidas de luminiscencia para cada diseño (20 nM) y lucKey (20 nM) en presencia o ausencia del ectodominio de HER2 (200 nM). Los valores de luminiscencia se normalizaron a 100 en ausencia del ectodominio HER2. Este experimento se realizó utilizando réplicas individuales en dos instancias independientes, se muestran datos representativos. El diseño 354_2S fue seleccionado como el mejor candidato debido a su alta sensibilidad y estabilidad, y recibió el nombre de lucCageHER2. g, Determinación de la sensibilidad de lucCagerHER2. La bioluminiscencia se midió durante 6000 s en presencia de proteína de ectodominio HER2 diluida en serie. Las concentraciones de lucCageBot:lucKey (en nM) fueron 5:5 (arriba), 1:10 (abajo) y 0,5:0,5 (abajo). h, cálculos de LOD para el sensor a diferentes concentraciones. Las concentraciones de lucCageBot:lucKey (en nM) fueron 5:5 (superior), 1:10 (medio) y 0,5:0,5 (inferior). Todos los experimentos se realizaron por triplicado a menos que se indique específicamente, se muestran datos representativos y los datos son media ± sd

a, Detección experimental de sensores diseñados para cTnI. Los fragmentos de cTnT, a saber, cTnTf1-f6, se injertaron computacionalmente en lucCage en diferentes posiciones del pestillo. Todos los diseños se produjeron en E. coli y se examinaron experimentalmente a lucKey 20 nM y 20 nM para determinar un aumento de la luminiscencia en presencia de cTnI 100 nM. Los valores de luminiscencia se normalizaron a 100 en ausencia de cTnI. Este experimento se realizó utilizando réplicas individuales en dos instancias independientes, se muestran datos representativos. El diseño 336-cTnTf6-K342A fue seleccionado como el mejor candidato (llamado lucCageTrop627) sobre la base de su sensibilidad, cambio de pliegue de activación y estabilidad. b, Modelos de lucCageTrop627 y lucCageTrop: una versión mejorada producida por fusión de cTnC en el extremo C de lucCageTrop627. Los modelos se muestran en una representación de cinta que comprende SmBit (dorado), un fragmento de cTnT (cian) (código PDB 4Y99) y cTnC (verde) (código PDB 4Y99). El recuadro negro muestra una vista de primer plano de la interfaz de la jaula (azul) y cTnT (cian) en el diseño de lucCageTrop. c, La afinidad de unión de lucCageTrop627 y lucCageTrop a cTnI se midió mediante interferometría de biocapa. lucCageTrop mostró una afinidad siete veces mayor por cTnI que lucCageTrop627. d, Comparación de la cinética de bioluminiscencia entre lucCageTrop627 (arriba) y lucCageTrop (abajo) en presencia de cTnI diluido en serie. Una mayor afinidad de unión conduce a un rango dinámico y una sensibilidad mejorados del sensor. e, Determinación de la sensibilidad de lucCageTrop. La bioluminiscencia se midió durante 6000 s en presencia de cTnI diluida en serie. Las concentraciones de lucCageTrop:lucKey (en nM) fueron 1:10, 1:1, 0,5:0,5 y 0,1:0,1 (de arriba a abajo). f, cálculos de LOD para el sensor a diferentes concentraciones. Las concentraciones de lucCageTrop:lucKey (en nM) fueron 1:10, 1:1, 0,5:0,5 y 0,1:0,1 (de arriba hacia abajo). Todos los experimentos se realizaron por triplicado a menos que se indique lo contrario, se muestran datos representativos y los datos son media ± sd

a, Los modelos de energía minimizada de los diseños de lucCage se muestran con los segmentos roscados de SmBiT (dorado) y el motivo antigénico de preS1 (magenta). El cuadro de la derecha muestra una vista de primer plano de la interfaz de motivo de jaula del diseño HBV344. b, Selección experimental de todos los diseños realizada mediante el control de la luminiscencia de cada lucCage (20 nM) y lucKey (20 nM) en presencia o ausencia del anticuerpo anti-HBV HzKR127-3.2 (100 nM). Los valores de luminiscencia se normalizaron a 100 en ausencia de anti-HBV. Este experimento se realizó por duplicado en dos instancias independientes y se muestran datos representativos. Se seleccionó el diseño HBV344 debido a su mejor rendimiento y se denominó lucCageHBV. c, d, Determinación de la sensibilidad de lucCageHBV. La bioluminiscencia se midió durante 6000 s en presencia de HzKR127-3.2 diluido en serie. Las concentraciones de lucCageHBV:lucKey fueron 5:5 nM (arriba) y 1:1 nM (abajo). Los valores máximos de las curvas en d se utilizan para obtener las curvas en c. e, cálculos de LOD para el sensor a diferentes concentraciones. Las concentraciones de lucCageHBV:lucKey fueron 5:5 nM (arriba) y 1:1 nM (abajo). f, Detección de preS1 por competencia de lucCageHBV344 y HzKR127-3.2 que se muestra en la Fig. 3f. Cinética de luminiscencia tras la adición del anticuerpo (anti-VHB, primera flecha). Las concentraciones de anticuerpos anti-VHB fueron 50 nM (arriba) y 12,5 nM (abajo). A los 6000 s, se inyectaron diferentes concentraciones del dominio preS1 en los pocillos (segunda flecha) y se usaron las señales de luminiscencia disminuidas para detectar preS1. g, Diseño de lucCageHBVα para mejorar la detección de un anticuerpo anti-VHB. El modelo estructural de lucCageHBVα se muestra con un detalle de primer plano de la interfaz predicha entre el epítopo preS1 (magenta) y lucCage (azul). El diseño consta de dos copias del epítopo preS1 (aminoácidos 35–46), separadas por un conector flexible (gris) para permitir la interacción bivalente con el anticuerpo. El péptido SmBit se muestra en dorado. h, Determinación de la sensibilidad de detección de lucCageHBVα a la presencia del anticuerpo HzKR127-3.2 (anti-HBV). La bioluminiscencia se midió durante 6000 s en presencia de HzKR127-3.2 diluido en serie. Las concentraciones de lucCageHBVα:lucKey (en nM) fueron 1:10 (superior) y 0,5:0,5 (inferior). i, se usó la región lineal de una curva de calibración para determinar el LOD de detección de anticuerpos. j, Imágenes de bioluminiscencia adquiridas con un sistema de imágenes BioRad ChemiDoc. Las concentraciones de lucCageHBVα:lucKey (en nM) son 50:5 (arriba), 5:5 (medio) y 1:10 (abajo). Se detectaron cambios en los niveles de bioluminiscencia en función de la concentración de HzKR127-3.2. Todos los experimentos se realizaron por triplicado a menos que se indique específicamente, y los datos representativos son la media ± sd

a, b, Detección experimental de sensores de novo para anticuerpos contra la proteína de membrana del SARS-CoV-2 (a) y la proteína de la nucleocápside (b). Los epítopos seleccionados de la proteína de membrana (M1, M3 y M4) y la proteína de la nucleocápside (N6 y N62) se injertaron computacionalmente en lucCage en diferentes posiciones del pestillo. Cada diseño constaba de dos copias en tándem de cada epítopo, separadas por un conector flexible, para aprovechar la unión bivalente de los anticuerpos. Todos los diseños se examinaron experimentalmente para detectar un aumento de la luminiscencia a 20 nM de cada diseño de lucCage y 20 nM de lucKey en presencia de anticuerpos policlonales de conejo anti-M (a) o anticuerpos monoclonales de ratón anti-N a 100 nM (clon 18F629.1 ) (b). Estos experimentos se realizaron por duplicado (a) o réplicas individuales (b) en dos instancias independientes, y se muestran datos representativos. Los valores de luminiscencia se normalizaron a 100 en ausencia de anticuerpos. Los diseños M3_1-17_334 y N62_369-382_340 fueron seleccionados como los mejores candidatos debido a su alta sensibilidad y estabilidad, y se denominaron lucCageSARS2-M y ucCageSARS2-N, respectivamente. c, Izquierda, modelo estructural de lucCageSARS2-M, que muestra una vista de primer plano de la interfaz predicha entre el epítopo M3 (rojo) y lucCage (azul). Medio, determinación de la sensibilidad de lucCageSARS2-M al anticuerpo policlonal anti-M. La bioluminiscencia se midió durante 4000 s en presencia de anticuerpo policlonal anti-M diluido en serie. Las concentraciones de lucCageSARS2-M:lucKey (en nM) fueron 50:50 (arriba) y 5:5 (abajo). Derecha, cálculos de LOD para el sensor a diferentes concentraciones. d, Izquierda, modelo estructural de lucCageSARS2-N, que muestra una vista de primer plano de la interfaz predicha entre el epítopo N62 (púrpura) y lucCage (azul). Medio, determinación de la sensibilidad de lucCageSARS2-N al anticuerpo monoclonal anti-N. La bioluminiscencia se midió durante 4000 s para lucCageSARS2-N más lucKey a 50 nM en presencia de anticuerpos anti-N diluidos en serie. Derecha, cálculos LOD para el sensor. Todos los experimentos se realizaron por triplicado a menos que se indique específicamente, se muestran datos representativos y los datos son media ± sd

a, Detección experimental de sensores de novo para el RBD de la proteína espiga del SARS-CoV-2. Todos los diseños se seleccionaron experimentalmente para aumentar la luminiscencia a 20 nM de cada diseño lucCage y 20 nM de lucKey en presencia de 200 nM RBD. Los valores de luminiscencia se normalizaron a 100 en ausencia de RBD. Este experimento se realizó por duplicado en dos instancias independientes y se muestran datos representativos. El diseño lucCageRBDdelta4_348 fue seleccionado como el mejor candidato debido a su alta sensibilidad y estabilidad, y recibió el nombre de lucCageRBD. b, Modelo estructural de lucCageRBD compuesto por el aglutinante LCB1 (magenta) injertado en lucCage (azul) que comprende un fragmento SmBiT enjaulado (dorado). Los recuadros negros muestran una vista de primer plano de la interfaz de la jaula (azul) y el aglutinante LCB1 (magenta) en el diseño lucCageRBD. c, Determinación de la sensibilidad de lucCageRBD. La bioluminiscencia se midió durante 10.000 s en presencia de proteína RBD diluida en serie. Las concentraciones de lucCageRBD: concentración de lucKey (en nM) fueron 1:1 (superior), 1:10 (medio) y 10:10 (inferior). d, cálculos de LOD para el sensor a diferentes concentraciones. Las concentraciones de lucCageRBD:lucKey (en nM) fueron 1:1 (superior), 1:10 (medio) y 10:10 (inferior). e, Imágenes de bioluminiscencia adquiridas con un sistema de imágenes BioRad ChemiDoc. Se detectaron cambios en los niveles de bioluminiscencia en función de la concentración de RBD con lucCageRBD 1 nM y lucKey 10 nM. f, Detección de RBD en matriz nasal simulada al 10%. A la izquierda, se midió la bioluminiscencia a lo largo del tiempo en presencia de proteína RBD diluida en serie. A la derecha, el LOD se calculó en 12 p.m. g, Detección de proteína espiga en un suero agrupado diluido al 20 %. A la izquierda, la bioluminiscencia se midió a lo largo del tiempo en presencia de proteína de punta HexaPro diluida en serie. A la derecha, el LOD se calculó en 47 pM. Todos los experimentos se realizaron por triplicado a menos que se indique lo contrario, se muestran datos representativos y los datos son media ± sd

a, b, Evaluación experimental del efecto de la longitud de lucKey (KCK) en el rango dinámico (DR) de lucCageRBD para detectar SARS-CoV-2 RBD monomérico. Una lucKey truncada (lucKey corta), 14 residuos más corta que la clave de longitud completa en su extremo C (b), proporciona un mejor rango dinámico que la lucKey de longitud completa (a) debido a la señal de fondo reducida, según lo predicho por la simulación en Datos extendidos Fig. 1f, mientras que el LOD sigue siendo el mismo. c, El efecto de la concentración de lucKey en el rango dinámico. La disminución de la concentración de lucKey aumenta el rango dinámico de lucCageRBD debido a la reducción de la señal de fondo, pero acompañada de una señal de bioluminiscencia máxima reducida. d, e, lucCageRBD (1 nM) se incubó con RBD 20 nM (d) o proteína de pico 20 nM (e), que se espera que den como resultado la reconstitución completa de la actividad de luciferasa. En presencia de proteína espiga, el mismo sensor no pudo producir la señal bioluminiscente máxima, lo que sugiere el efecto de factores no capturados por las simulaciones, como el impedimento estérico contra la reconstitución completa de luciferasa. f, lucCageHBVα (1 nM) incubado con 50 nM del anticuerpo contra el VHB HzKR127-3.2 muestra una activación casi completa, pero una señal de fondo alta. g, lucCageTrop (1 nM) muestra una señal de fondo no ideal y una activación controlada por el objetivo moderada en presencia de cTnI 20 nM. Todos los experimentos se realizaron por triplicado, se muestran datos representativos y los datos son la media ± sd

a, Los espectros de emisión bioluminiscente de lucCageRBD (izquierda) en respuesta a concentraciones variables de RBD. Antares2 es un sistema CyOFP1-teLuc-CyOFP1 BRET eficiente40 con un pico de emisión a 590 nm (centro). Los espectros de emisión se registraron a partir de una mezcla de lucCageRBD y lucKey (ambos a 1 nM), Antares2 (0,1 nM) y RBD a concentraciones variables (derecha). Al adquirir la señal individual de los canales de 470/40 nm y 590/35 nm, las respuestas intensiométricas de lucCageRBD se convirtieron en lecturas radiométricas. b, Ecuaciones para calcular la relación espectralmente no mezclada. La señal total del canal 470/40 nm (T470) es la suma de las señales del sensor lucCageRBD (I470) y la referencia Antares2 (R470), y la señal total del canal 590/35 nm (T590) es igual a la señal del sensor (I590) más la señal de referencia (R590). Debido a que lucCageRBD genera una emisión insignificante en el canal de 590/35 nm, T590 es aproximadamente igual a R590 (R590 >> I590). R470 es R590 × f, una constante predeterminada para Antares2 y, por lo tanto, la relación sin mezclar (I470/R590) podría calcularse en tiempo real durante la adquisición de la señal. La constante f para Antares2 se determinó consistentemente en 0,43, ya sea mediante el registro de los espectros completos o del conjunto de filtros. c, Se agregaron concentraciones variables de RBD en suero agrupado al 50 %, 25 % o 10 % o en fluido nasal simulado al 20 %. Las intensidades de bioluminiscencia absoluta y la cinética de emisión fueron diferentes entre las matrices debido al efecto de inhibición de la matriz y al recambio del sustrato53. Por el contrario, la calibración con Antares2 dio como resultado señales radiométricas estables (I470/R590). d, La intensidad de la bioluminiscencia de lucCageRBD a una concentración saturada de RBD (curva verde) es aproximadamente 20 veces mayor que el nivel de fondo. Informar la relación bruta (T470/T590) en función de la concentración de RBD compromete el rango dinámico del sensor (curva negra) debido a una emisión notable en el canal de 470/40 nm (R470) de Antares2. Después del cálculo y la conversión de la relación sin mezclar, el rango dinámico se vuelve 20 veces más alto que el nivel de fondo con lecturas radiométricas (curva magenta). e, La detección de RBD enriquecidos en cuatro sueros humanos anonimizados diferentes (50 %) muestra que la calibración utilizando Antares2 con resolución espectral como referencia interna puede minimizar las variaciones de la bioluminiscencia intensiométrica en estas matrices. Las señales bioluminiscentes y sd se midieron por triplicado, y se muestra una representativa para los espectros de emisión y la cinética de emisión, respectivamente. Los datos son media ± sd

Este archivo contiene la discusión complementaria, los métodos complementarios, las referencias complementarias, la figura complementaria 1 y las tablas complementarias 1-6.

Reimpresiones y permisos

Quijano-Rubio, A., Yeh, HW., Park, J. et al. Diseño de novo de biosensores de proteínas modulares y sintonizables. Naturaleza 591, 482–487 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03258-z

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Recibido: 13 junio 2020

Aceptado: 19 enero 2021

Publicado: 27 enero 2021

Fecha de emisión: 18 de marzo de 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03258-z

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