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Sep 29, 2023

Un modelo de minipig humanizado para la prueba toxicológica de anticuerpos recombinantes terapéuticos

Naturaleza Ingeniería Biomédica

Nature Biomedical Engineering volumen 6, páginas 1248–1256 (2022)Citar este artículo

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La seguridad de la mayoría de las proteínas recombinantes humanas se puede evaluar en ratones transgénicos tolerantes a proteínas humanas específicas. Sin embargo, debido a la insuficiente diversidad genética y a las diferencias fundamentales en los mecanismos inmunológicos, los modelos de animales pequeños de enfermedades humanas a menudo no son adecuados para las pruebas de inmunogenicidad y para predecir resultados adversos en pacientes humanos. La mayoría de los anticuerpos terapéuticos humanos desencadenan respuestas xenogénicas en animales de tipo salvaje y, por lo tanto, una eliminación rápida de los fármacos, lo que hace que las pruebas toxicológicas in vivo de anticuerpos humanos sean un desafío. Aquí informamos la generación de minicerdos de Göttingen que portan un minirrepertorio de genes humanos para las cadenas pesadas de inmunoglobulina γ1 y γ4 y la cadena ligera de inmunoglobulina κ. De acuerdo con las observaciones en pacientes humanos, los minicerdos genéticamente modificados toleraron los anticuerpos monoclonales de isotipo IgG1κ clínicamente no inmunogénicos daratumumab y bevacizumab, y provocaron anticuerpos contra el inhibidor del punto de control atezolizumab y la interleucina diseñada cergutuzumab amunaleukina. Los minipigs humanizados pueden facilitar las pruebas de seguridad y eficacia de los anticuerpos terapéuticos.

La eficacia y la seguridad de los anticuerpos monoclonales (mAb) pueden verse comprometidas si la administración de un compuesto provoca una respuesta inmunitaria en humanos, que se manifiesta por el desarrollo de anticuerpos antidrogas (ADA). Varios factores pueden inducir ADA y se clasifican en relación con el paciente, la enfermedad, el producto o el tratamiento. Pueden conducir a síntomas leves o potencialmente mortales que están bien documentados para varias proteínas terapéuticas clínicamente aprobadas1. Estas reacciones adversas varían entre los compuestos y son difíciles de predecir. Todavía existen lagunas importantes en la comprensión de la farmacocinética de los ADA, su capacidad de neutralización y su reactividad cruzada con moléculas endógenas u otros compuestos biológicos.

Para abordar estos inconvenientes, se han desarrollado varios modelos preclínicos in silico e in vitro diferentes2,3,4,5,6,7. La evaluación de la inmunogenicidad en modelos in vivo incluye ensayos con animales en el contexto de un sistema inmunitario intacto. Sin embargo, cualquier proteína humana probablemente provocará una respuesta inmunitaria en un animal de prueba debido a las diferencias entre especies. Esto se puede eludir mediante el uso de anticuerpos sustitutos específicos para la especie animal (pero su valor predictivo puede cuestionarse) o animales transgénicos que expresen la proteína humana y, por lo tanto, la reconozcan como 'propia'. Cualquier respuesta inmunitaria provocada será por tanto debida al estado alterado de la proteína recombinante. Para evitar la generación de líneas animales transgénicas separadas para proteínas terapéuticas individuales, algunos grupos de investigación, incluido el nuestro, generaron ratones transgénicos que expresan conjuntos de genes de inmunoglobulina humana8,9,10. A diferencia de la mayoría de los modelos de ratones humanizados con anticuerpos (Ab) para el descubrimiento de Ab, nuestros animales transgénicos aún expresan sus genes de inmunoglobulina endógena (Ig) y, por lo tanto, son completamente inmunocompetentes. La función de los transgenes de Ig humana es únicamente inducir tolerancia y no necesariamente tienen que estar implicados en una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, las líneas de ratón establecidas por nosotros llevan un mini-repertorio de IgG1 humano compuesto solo por la forma secretada de cadenas pesadas de Ig-γ1 humana, así como cadenas ligeras de Ig-κ e Ig-λ. Los genes incluidos son los más utilizados en humanos así como en la producción de anticuerpos terapéuticos11. Estos ratones transgénicos permiten estudios de inmunogenicidad para toda una categoría de anticuerpos terapéuticos humanos y la evaluación de modificaciones potencialmente inmunogénicas en preparaciones de Ab10. Sin embargo, por razones anatómicas y de vida útil obvias, los datos obtenidos en ratones no siempre se pueden traducir directamente a humanos en términos de rutas de aplicación, farmacocinética y evaluaciones toxicológicas a largo plazo12. El Consejo Internacional para la Armonización (ICH) de los Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos para Uso Humano requiere pruebas preclínicas de seguridad en una especie de roedor y una especie de no roedor. En el caso de los anticuerpos terapéuticos, los primates no humanos (NHP) suelen ser la única opción. La disponibilidad de un modelo universal que no sea de roedores ni de NHP para la evaluación de posibles propiedades inmunogénicas e inmunotóxicas de Abs recombinantes humanos sería una herramienta valiosa. Mejoraría la seguridad preclínica para este mercado en rápido crecimiento.

El cerdo tiene muchas ventajas para los estudios preclínicos, siendo similar a los humanos en tamaño, en la anatomía de muchos sistemas de órganos y en sus respuestas fisiológicas y fisiopatológicas. Los cerdos tienen un tiempo de gestación relativamente corto, camadas de gran tamaño, maduración rápida y facilidad de alojamiento en condiciones libres de patógenos específicos. Es importante destacar que las similitudes inmunológicas con los humanos hacen del cerdo un modelo ideal para la investigación preclínica13,14,15. Al igual que con los ratones, los métodos de ingeniería genética ahora están bien establecidos para los cerdos.

Sobre la base de los resultados previos en ratones10, se generaron minipigs transgénicos de Göttingen que portaban un repertorio similar de genes de cadena de Ig humana pesada (IGH) e Ig κ ligera (IGK). El esquema del proyecto se presenta en la Fig. 1a. Se generaron dos vectores de expresión. La primera construcción incluye segmentos del gen IGH de la línea germinal no reorganizados que codifican 5 elementos variables (V), 5 de diversidad (D) y 6 de unión (J) en combinación con la secuencia requerida para impulsar la producción de cadenas H secretoras de IgG1 humana (hIgG1). Para evaluar si no solo se puede expresar hIgG1 sino también el isotipo hIgG4, la región constante γ4 (Cγ4) y las secuencias de cambio correspondientes (Sμ, Iγ-Sγ) también se incluyeron en esta construcción (Fig. 1b, IGH-γ1-γ4; Número de acceso al NCBI: OL809665). Se eligieron IgG1 y hIgG4 humanas porque son los dos isotipos de Ig más utilizados en los mAbs terapéuticos humanos16. La construcción IGH-γ1-γ4 debería permitir el cambio de isotipo de Ig de Cγ1 a Cγ4. La segunda construcción contiene segmentos del gen IGK que codifican elementos 2V y 5J más la secuencia que codifica para la región constante κ (C) (Fig. 1c, IGK; número de registro de NCBI: OL809666). Tras una reorganización adecuada, estos elementos génicos deberían generar un repertorio de proteínas IgG solubles humanas sin interferir con el proceso de reorganización y formación de repertorio de proteínas Ig porcinas endógenas, ya que esto requiere la expresión de la Ig humana unida a la membrana, que no está incluida en el construcción transgénica (ver Fig. 1b). Todos los genes V utilizados en las construcciones se eligieron sobre la base de su uso predominante en sangre periférica humana11 y en el modelo de ratón transgénico se demostró que proporcionaban una amplia tolerancia a IgG1 Abs10 humano.

a, Una descripción general del proyecto que muestra la generación y aplicación de minicerdos transgénicos IgG humanos. b, la forma secretada de la cadena pesada de inmunoglobulina (IGH-γ1-γ4) yc, la cadena ligera κ (IGK). Figura creada con BioRender.com.

Se cotransfectaron fibroblastos renales aislados de minipigs machos de Göttingen con los vectores de expresión IGH-γ1-γ4 (31,4 kb) e IGK (10,9 kb) y un gen marcador seleccionable (fosfoglicerato quinasa (PGK) impulsada por blasticidina, BS; 1,05 kb) . Los clones de una sola célula se aislaron y examinaron mediante PCR para detectar la presencia de los tres transgenes. Se agruparon de cuatro a cinco clones de células y se usaron para la transferencia nuclear de células somáticas, lo que resultó en el nacimiento de ocho lechones machos de Göttingen nacidos vivos. Todos fueron positivos para la presencia de los tres transgenes (no mostrados). Cuatro animales fundadores alcanzaron la madurez sexual (TG1-TG4). Los cuatro portaban 2 copias del transgén humano IGH-γ1-γ4 e IGK según lo determinado por PCR de gotas, pero difieren en el número de copias para el gen marcador seleccionable (TG1–TG3, 1 copia; TG4, 3 copias). A excepción de TG4, todos los animales fundadores expresaron la cadena pesada (HC) y ligera (LC) de IgG humana (Fig. 2). En consecuencia, solo se utilizaron TG1–TG3 para el mejoramiento posterior. Todos los descendientes (F1-F3) exhibieron herencia de transgenes mendelianos, lo que indica inserción en un solo locus genómico, y el fundador y el descendiente mostraron niveles similares de IgG humana en el suero (Fig. 2a, b) y fenotipo reproducible (Figs. 3 y 4) . A diferencia de los ratones transgénicos IgG1 humana10, no se detectaron moléculas IgG1 híbridas (humana/cerda) en los minicerdos transgénicos. Un ELISA tipo sándwich de doble anticuerpo que capturó la LC de Igκ humana y detectó la HC de Ig humana demostró la expresión de IgG completamente humana (datos ampliados, figura 1).

a, Western blot que muestra la expresión de proteínas IgG heavy γ1 (IgH-γ1) y κ light (IgL-κ) en suero aislado del fundador transgénico (TG1–-TG3) IgG minipigs y animales F1 de las líneas TG2 y TG3. Los minipigs WT Göttingen fueron negativos para la presencia de ambas proteínas. Se usaron proteína IgG humana y PBS como control positivo y negativo, respectivamente. Las imágenes sin procesar de todas las transferencias Western se muestran en los Datos complementarios 1. b, La presencia de proteína IgG1 humana se confirmó aún más mediante análisis ELISA en suero aislado de minicerdos F1 que representan las 3 líneas (TG línea 1, n = 5; TG línea 2, n = 4; TG línea 3, n = 3). No se detectó IgG1 humana en animales WT (n = 4). La barra horizontal representa la mediana. Cada punto de datos representa una réplica biológica. c, los genes de la cadena pesada y ligera κ de IgG humana experimentan reordenamientos de genes funcionales. Se representa una selección de reordenamientos de los cuatro transgenes VH y los dos Vκ. Los reordenamientos de los genes humanos VH y VΚ muestran adiciones de N nucleótidos. La secuencia de IgG4 humana de las variantes de cambio de isotipo se muestra en marrón. Los elementos J en los genes V reordenados se dan entre paréntesis, los elementos del gen D identificados están subrayados e indicados a la derecha.

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a, minipigs transgénicos de IgG humana (n = 2) montan respuestas de anticuerpos anti-KLH de IgG porcina a niveles comparables a los de los animales WT (n = 2) tras una inmunización única con KLH en adyuvante de alumbre. b, Los minipigs transgénicos de IgG humana (n = 2) pueden generar respuestas de memoria después de la reexposición con KLH en el día 35 (flecha). La línea roja punteada indica un umbral arbitrario a un título de 200. Análisis estadístico mediante análisis de varianza de 2 vías (ANOVA); NS, no significativo. La barra horizontal representa la mediana. Cada punto de datos representa una réplica biológica.

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a, Esquema esquemático de la estrategia de inmunización sin adyuvante. Las muestras de sangre para el análisis de ADA se extraen antes de cada tratamiento. b, Título de anticuerpos anti-bevacizumab IgG porcino después de la inmunización de 6 minicerdos fundadores transgénicos (TG) hIgG y 6 controles WT con bevacizumab. Datos resumidos de 3 estudios individuales, cada uno con 2 minipigs transgénicos y 2 WT. c, Título de anticuerpos anti-bevacizumab IgG porcino después de la inmunización de 4 minicerdos transgénicos hIgG de la generación F1 y 4 animales WT con bevacizumab. d, DO de anticuerpos IgG porcinos anti-daratumumab medidos mediante ELISA en minipigs (TG, n = 4; WT, n = 4) inmunizados con daratumumab. La línea roja punteada indica un umbral arbitrario a un título de 200 o media + 6×sd umbral en el caso de OD. Análisis estadístico por ANOVA de 2 vías. La barra horizontal representa la mediana. Cada punto de datos representa una réplica biológica.

Datos fuente

Para caracterizar el reordenamiento de los segmentos del gen V humano en linfocitos B porcinos, se aislaron muestras de ARN mensajero (ARNm) de la sangre periférica de un minicerdo transgénico. El análisis de la secuencia confirmó los reordenamientos V(D)J funcionales de los segmentos del gen humano variable pesado (VH) y kappa ligero (VK), así como adiciones de N nucleótidos para la cadena pesada y ligera. Este último indica un reordenamiento coordinado temporalmente de los genes humanos de cadena pesada y ligera durante el funcionamiento de la desoxinucleotidil transferasa (TdT) terminal porcina responsable de la adición de N-nucleótidos en la unión de las inmunoglobulinas reorganizadas. Esto también se ha observado en el modelo de ratón análogo10. Además, la secuencia de VH humana contenía intercambios de aminoácidos (ver la Fig. 1 complementaria) debido a mutaciones somáticas fuera de las regiones determinantes de la complementariedad (Fig. 2c). Todos los intentos de detectar la proteína IgG4 en el suero de minipigs transgénicos hIgG no tuvieron éxito. Sin embargo, el análisis de secuenciación de ARN reveló una pequeña proporción de genes IgG4 cambiados (0, 76%; Fig. 2c y Fig. 1 complementaria). Si bien esto prueba que se produce un cambio de isotipo de IgG, es un evento raro y explica por qué no se detectaron proteínas IgG4 humanas. Todo esto indica que las proteínas porcinas y humanas son compatibles y que el reordenamiento de los genes de IgG humanos procede de manera eficiente en los minipigs transgénicos.

Los animales hIgG están sanos y no sufren una mayor carga de infección. La necropsia de los animales mostró una apariencia normal del bazo, los ganglios linfáticos y la médula ósea (datos no mostrados).

La competencia inmunológica también se confirmó experimentalmente utilizando el antígeno modelo dependiente de células T hemocianina de lapa californiana (KLH)16, cuya respuesta está bien documentada para los minipigs de Göttingen17. Dos minicerdos hIgG y dos de tipo salvaje (WT) se inyectaron por vía subcutánea (sc) con una dosis única de 20 mg kg−1 de peso corporal de KLH en adyuvante de alumbre y se siguió la respuesta de anticuerpos específicos de KLH durante 35 días. Los cuatro minipigs montaron una respuesta IgM (no mostrada) e IgG 1 semana después de la inmunización, lo que confirma que la expresión del transgén no altera las respuestas Ab dependientes de células T a esta proteína (Fig. 3a). En un experimento de refuerzo posterior, la primera dosis de KLH fue seguida de una nueva exposición de los animales a una segunda dosis el día 35. El rápido aumento de los títulos de IgG porcina específica de KLH después de la inmunización de refuerzo demuestra que los minipigs humanizados también son capaces de montar un respuesta de memoria (Fig. 3b). Como se esperaba, no se detectó IgG humana específica de KLH (datos no mostrados). Por lo tanto, como se observó previamente para ratones transgénicos hIgG110, la expresión de IgG humana no compromete la capacidad inmune de los minipigs de Göttingen.

A continuación, evaluamos el estado de tolerancia de los minipigs humanizados al prototípico Abs terapéutico humano bevacizumab y daratumumab. Ambos son anticuerpos clásicos del isotipo IgG1 humano con bajas tasas de inmunogenicidad (inferiores al 1%) en pacientes1.

Se inyectaron repetidamente bevacizumab (0,4 mg kg−1 de peso corporal, 7 inyecciones; Fig. 4a) a minipigs transgénicos y de tipo salvaje de IgG humana. Se recogieron muestras de suero semanales y se midió la IgG ADA porcina mediante ELISA. El tratamiento con bevacizumab resultó en la formación de ADA en minipigs de tipo salvaje, pero no en los minipigs fundadores que expresan hIgG (Fig. 4b) o su descendencia F1 (Fig. 4c), lo que demuestra la tolerancia inmune hacia la IgG1 humana y confirma la herencia del rasgo.

El tratamiento con daratumumab no provocó un aumento sustancial de los títulos de ADA ni en los animales transgénicos ni en los de tipo salvaje. Sin embargo, los datos sin procesar revelaron un aumento tardío débil pero apreciable en las señales de ADA en los animales de tipo salvaje que no se encuentran en el grupo de minicerdos transgénicos (Fig. 4d).

Todos los hallazgos están en línea con nuestros resultados anteriores de ratones transgénicos IgG, en los que también se encontró que ambos Abs no eran inmunogénicos, mientras que los ratones de tipo salvaje mostraron una respuesta ADA fuerte (bevacizumab) o moderada (daratumumab)10 (Tabla complementaria 1).

Para determinar el potencial de este modelo para evaluar la inmunogenicidad de Abs humanos terapéuticos, se trataron cohortes de cuatro minicerdos hIgG y WT con 0,4 mg kg−1 de peso corporal de atezolizumab o cergutuzumab. Se sabe que inducen respuestas de ADA en el 39 % y el 70 % de los pacientes, respectivamente18,19. Todos los minipigs desarrollaron respuestas ADA. No hubo diferencias significativas en el título de ADA entre los minicerdos transgénicos IgG humanos y sus compañeros de camada de tipo salvaje después del tratamiento con cergutuzumab amunaleukin (Fig. 5a). Por el contrario, el título de ADA fue significativamente más bajo para los minicerdos humanizados después del tratamiento con atezolizumab (P = 0,0075) (Fig. 5b), lo que refleja la diferencia en la inmunogenicidad entre estos dos Ab terapéuticos. Los resultados en los minicerdos transgénicos IgG humanos recapitulan los observados en humanos y los datos de estudios en ratones transgénicos hIgG120.

a, Anticuerpos porcinos IgG anti-cergutuzumab amunaleukina después de la inmunización (minipigs TG, n = 4; minipigs WT, n = 4) con cergutuzumab amunalukin. b, Anticuerpos anti-atezolizumab IgG porcino después de la inmunización con atezolizumab. La línea roja punteada indica un umbral arbitrario a un título de 200. Análisis estadístico mediante ANOVA de 2 vías. La barra horizontal representa la mediana. Cada punto de datos representa una réplica biológica.

Datos fuente

Para garantizar la previsibilidad de los estudios farmacológicos, la ICH recomienda el uso de modelos animales relevantes. Sin embargo, los estudios toxicológicos, farmacocinéticos y farmacodinámicos prolongados con proteínas recombinantes, incluidos los anticuerpos terapéuticos, se ven obstaculizados por la respuesta inmunitaria del animal contra las proteínas extrañas. Para superarlos, durante las últimas décadas, la mayoría de las proteínas recombinantes humanas se han evaluado en ratones transgénicos tolerantes a la proteína humana específica21 y, en el caso de los anticuerpos, en modelos de ratones tolerantes a IgG8,9,10. Sin embargo, varios factores han limitado su aplicación para la evaluación de la inmunogenicidad. Estos incluyen la falta de diversidad genética y las diferencias fundamentales en los mecanismos inmunológicos entre las cepas de ratones endogámicos22,23. Además, el tamaño de los ratones limita su uso para estudiar la inmunogenicidad a través de ciertas vías de aplicación, como la dosificación intravítrea. Debido a la similitud en la anatomía, fisiología y bioquímica porcina y humana, se ha sugerido a los cerdos como un modelo no roedor adecuado para las pruebas preclínicas de seguridad. La mayoría de las proteínas, incluidas las del sistema inmunológico, comparten similitudes estructurales y funcionales con sus contrapartes humanas. En comparación con los ratones, el sistema inmunitario de los cerdos se parece más al de los humanos24 y son menos endogámicos que las cepas de ratones. Se han desarrollado varias líneas de minipigs (Hanford, Yucatan, Yucatan micro, Sinclair y Göttingen) y se usan comúnmente para la evaluación preclínica de seguridad25. Los minipigs de Göttingen tienen antecedentes genéticos y parámetros fisiológicos bien definidos (parámetros hematológicos y de química clínica, hemodinámica), lo que los convierte en un animal modelo ideal. Sin embargo, debe mencionarse que los cerdos requieren costos más altos en comparación con los modelos de roedores porque se necesitan más reactivos experimentales, cuidado de los animales y cría. Sin embargo, el tamaño y la anatomía/fisiología de los cerdos permiten estudios farmacocinéticos y vías de administración más relevantes, como la inyección intravítrea y la inhalación, que son difíciles de lograr en ratones.

Hemos descrito un modelo de minipig de Göttingen modificado genéticamente para su uso en estudios preclínicos con anticuerpos humanos recombinantes. Mediante la introducción de un mini-repertorio de genes IgG1 e IgG4 humanos en la línea germinal porcina, hemos generado minipigs que son tolerantes a la mayoría, aunque no a todos, los anticuerpos recombinantes humanos.

Hemos demostrado el reordenamiento exitoso de los genes de línea germinal IGH-γ1-γ4 e IGK humanos y la producción de proteínas IgG humanas en suero. La incorporación de secuencias de cambio humano (Sμ, Ig-Sγ1) en la construcción transgénica dio como resultado la expresión de ARNm de IgG4, lo que indica un procesamiento adecuado por parte de la maquinaria de cambio porcino. Los minipigs transgénicos transmitieron los nuevos rasgos de forma estable a su progenie. Aunque se expresó en niveles bajos, la cantidad de proteína IgG humana fue suficiente para inducir y preservar la tolerancia inmunológica a los Abs IgG1 humanos.

Mostramos tolerancia inmunológica a los Abs humanos mediante el uso de cuatro Abs terapéuticos que provocan (atezolizumab, cergutuzumab amunaleukin) o carecen (daratumumab, bevacizumab) de inmunogenicidad clínica. Como era de esperar, atezolizumab y cergutuzumab amunaleukin indujeron ADA en los minicerdos transgénicos hIgG, y bevacizumab y daratumumab no. La respuesta inmunitaria contra bevacizumab fue fuerte en minicerdos de tipo salvaje, pero baja después del tratamiento con daratumumab. Daratumumab es una inmunoterapia aprobada para el mieloma múltiple que reduce las células cancerosas que expresan CD3826. No podemos excluir la unión residual de daratumumab a CD38 porcino y el posterior agotamiento de las células plasmáticas secretoras de ADA, lo que puede explicar la baja respuesta inmune. Aunque hemos demostrado tolerancia a una variedad/cantidad de anticuerpos IgG1 humanos, se requieren más experimentos para evaluar la tolerancia a una gama mucho más amplia de anticuerpos humanos.

Se supone que el motivo de la formación de ADA en respuesta a los anticuerpos contra la amunaleucina de atezolizumab y cergutuzumab está relacionado con su modo de acción. La variante de interleucina-2 (IL-2) de cergutuzumab amunaleukina reacciona de forma cruzada con el receptor de IL-2 de humanos y cerdos (sobre la base de homología de secuencia y datos experimentales27), que se sabe que desempeña funciones importantes en la inmunidad y la tolerancia28 . Atezolizumab forma un estrecho contacto con el ligando 1 de muerte programada humana (PD-L1) a través de 16 residuos de aminoácidos clave29, que están altamente conservados entre humanos, ratones y cerdos. Sobre la base de la estructura cristalina del complejo PD-L1/atezolizumab humano29, generamos un modelo estructural in silico de la interacción PD-L1/atezolizumab de ratón y porcino que sugiere propiedades de unión más fuertes para el complejo porcino en comparación con las de los ratones (Suplementario Figura 2). Sobre la base de estos datos y del hecho de que la interacción de atezolizumab con PD-L1 de ratón se ha confirmado experimentalmente30, se puede suponer una reactividad cruzada similar con PD-L1 porcino. Por lo tanto, el mecanismo de inmunogenicidad podría estar asociado con la inhibición de la interacción PD1/PD-L1, un importante regulador de la autotolerancia31.

Es bien sabido que la farmacología de los anticuerpos terapéuticos al unirse a sus dianas es un factor importante de toxicidad e influye en el perfil de inmunogenicidad32,33. En consecuencia, la falta de reactividad cruzada limitaría la utilidad de los modelos animales transgénicos hIgG. Dado que los datos actuales muestran una gran similitud de secuencia entre la mayoría de los antígenos humanos y porcinos, esto no debería plantear un problema34,35,36, pero debería tenerse en cuenta para cada nuevo anticuerpo que se esté analizando.

La sensibilidad con la que los minipigs transgénicos hIgG responden a compuestos inmunogénicos mientras toleran Abs no inmunogénicos los convierte en un modelo ideal para las evaluaciones de seguridad de anticuerpos terapéuticos y la predicción de posibles efectos secundarios.

La ICH solicita que las pruebas preclínicas de seguridad se lleven a cabo en modelos animales predictivos: una especie de roedor y una especie de no roedor. Las líneas de ratón generadas anteriormente y los minipigs humanizados recién derivados cumplen estos requisitos para los anticuerpos recombinantes humanos y, por lo tanto, podrían permitir pruebas de seguridad y eficacia y reducir la necesidad de estudios en NHP.

El permiso para la generación de cerdos transgénicos y la realización de experimentos con animales fue emitido por el gobierno de la Alta Baviera, Alemania (ROB-55.2-1-54-2532-6-13). Los experimentos se realizaron de acuerdo con la Ley de Bienestar Social de Alemania y la Normativa de la Unión Europea para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación.

Se generaron dos construcciones de ADN recombinante que codifican la forma soluble de la cadena pesada γ (IGH) de Ig humana y la cadena ligera κ de Ig (IGK) como se describió previamente10. La construcción IGH-γ1-γ4 (31,4 kb) comprende una región de 10,9 kb que contiene cinco regiones variables (VH 1-69, VH 4-59, VH 3-30, VH 3-23, VH 1-18), cinco regiones de diversidad (DH3-3, DH 4-4, DH2-8, DH3-9, DH3-10), un fragmento de 8,5 kb que contiene los elementos de unión JH-1 a JH-6, una región de potenciador e interruptor intrónico (Sμ) y una Fragmento de 9,1 kb que contiene constantes γ-1 (exones 1–4) y γ-4 (exones 1–4) que codifican las isoformas IgG1 e IgG4 secretadas. Todas las regiones estaban flanqueadas por secuencias endógenas del gen IGH humano de entre 400 pb y 1,3 kb de longitud. El constructo IGK (10,9 kb) comprende un fragmento de 1,5 kb que contiene dos regiones variables (Vκ 3-20 y Vκ 1-17), un fragmento de 5,6 kb que contiene cinco elementos de unión Jκ-1 a Jκ-5, una región C y un ratón Elemento potenciador (E) 3' de Igκ. Todos los fragmentos estaban flanqueados por secuencias endógenas del gen IGK humano de entre 500 pb y 1,7 kb de longitud.

Se aislaron fibroblastos de riñón porcino (PKF) de un minicerdo Göttingen macho mediante el método estándar37. Los PKF se cultivaron con DMEM con alto contenido de glucosa complementado con FBS al 10 % (suero bovino fetal), NEAA 2 mM (aminoácidos no esenciales) y l-glutamina 2 mM. Las células se pasaron cada 3 a 5 días y se mantuvieron con una confluencia del 50 al 90 % en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2. Todos los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich.

Se sometieron a electroporación 1–2 PKF pasadas (Eporator, Eppendorf) con vectores de expresión IGH-γ1-γ4 (31,4 kb) e IGK (10,9 kb) y un gen marcador seleccionable (blasticidina impulsada por PGK, BS; 1,05 kb) a una concentración de 13 μg, 4,5 μg y 0,05 μg, respectivamente (relación molar de 10:10:1). Los tres transgenes se prepararon para la transfección eliminando el esqueleto del plásmido. Las construcciones de IGK e IGH-γ1-γ4 se purificaron mediante electroforesis y electroelución de campo pulsado preparativo, y el casete de expresión de BS mediante electroforesis en gel de agarosa utilizando el kit Wizard (Sigma-Aldrich). Para la transfección, las células se sometieron a un pulso eléctrico de 1200 V durante 85 μs, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 5 min. A las 48 h posteriores a la transfección, las células se seleccionaron con 8 μg ml-1 de BS. Se aislaron clones de células transfectadas estables individuales, se crioconservaron muestras de cada clon en una etapa temprana y se cultivaron réplicas de muestras para análisis adicionales.

El ADN aislado de clones de células transfectadas estables individuales se usó para la detección mediante PCR. Se utilizaron los siguientes cebadores para identificar la presencia del transgén IGH-γ1-γ4: IGH_F e IGH_R para amplificar el fragmento de 1,4 kb, transgén IGK: IGK_F e IGK_R para amplificar el fragmento de 1,26 kb. Para el transgén BS: se usaron cebadores BS_F y BS_R para amplificar el fragmento de 0,5 kb. Las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla complementaria 2. La PCR se llevó a cabo utilizando la polimerasa GoTaq. Los parámetros del ciclo térmico fueron: 5 min, 95 °C; luego 35 ciclos de: 15 s, 95 °C; 30 s, 60 °C; 1 minuto, 72 °C; seguido de 5 min, 72 °C.

La transferencia nuclear se realizó como se describió previamente38. Brevemente, se enuclearon los ovocitos madurados in vitro y se colocó una única célula donante en el espacio perivitelino de cada ovocito. Después de la fusión y la activación del embrión, los embriones reconstituidos se transfirieron al oviducto de primerizas receptoras sincronizadas con el ciclo hormonal. Se transfirieron entre 80 y 120 embriones reconstruidos a cada primeriza receptora.

La ddPCR se realizó como se describió previamente39. El número de copias del transgén se determinó utilizando sondas marcadas con fluorescencia: IGH 5'FAM-ATGGGCACGACCGACCTGAGC-BHQ3' (cebadores: dIGH_F y dhIGH_R); IGK 5´FAM-AGGGCTTCACAGATAGAGCTCATTTT-BHQ3´ (cebadores: dIGK_F y dIGK_R). La sonda GAPDH 5′HEX-TGTGATCAAGTCTGGTGCCC-BHQ3′ (dGAPDH_F y ddGAPDH_R) se utilizó como referencia. Las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla complementaria 2. Los genes objetivo se cuantificaron utilizando el sistema QX100 (BioRad Laboratories).

La sangre de un minicerdo transgénico IgG humano macho de 1 año de edad (F3) se recolectó en tubos K2EDTA y posteriormente se mezcló con RNAlater y se almacenó a -80 °C. El ARN de la sangre se extrajo utilizando el kit de purificación de ARN de sangre RiboPure (Invitrogen). El número de integridad del ARN (RIN) fue >9 según lo determinado por el bioanalizador Agilent 2100. El ARN se transcribió usando SuperScript IV VILO Master Mix (Invitrogen) con 500 ng de ARN total como entrada. Posteriormente, los transcritos de IgG humana recombinados se amplificaron mediante PCR utilizando un kit de PCR de alta fidelidad Q5 (NEB). En primer lugar, se usaron siete cebadores directos específicos para diferentes segmentos de cadena ligera kappa variable y pesada variable en combinación con cebadores inversos que se unían a secuencias comunes de cadena ligera kappa constante y pesada constante. A continuación, los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen). Los productos de la PCR de las reacciones de la cadena pesada se usaron como molde para la PCR anidada con otro conjunto de cinco pares de cebadores. Todas las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla complementaria 2. Posteriormente, se prepararon bibliotecas de secuenciación de Illumina a partir de 10 pM de cada producto de PCR purificado utilizando el protocolo de preparación de muestras de ADN TruSeq Nano (Illumina). Las bibliotecas de muestras se secuenciaron en una ejecución de Illumina MiSeq mediante secuenciación de extremos emparejados durante 2 × 300 ciclos.

Ambos pares de lecturas de extremos emparejados superpuestos se fusionaron utilizando la herramienta usearch versión 0.667_i86linux32 y los parámetros -fastq_pctid 75 y -fastq_maxdiffs 2540. Posteriormente, las lecturas se tradujeron a secuencias de aminoácidos en el marco anticipado y se filtraron para detectar la presencia de 5 aminoácidos adyacentes esperados. ácidos y la ausencia de codones de parada para obtener reordenamientos potencialmente funcionales. La figura complementaria 1a muestra los números de lectura obtenidos.

MyOne Streptavidin T1 Dynabeads (Invitrogen) se lavaron y recubrieron con 4 μg de IgG1 antihumana de ratón biotinilada (clon HP6069, Invitrogen) o 5 μg de Ig κ antihumana de ratón biotinilada (clon G20-193, BD) por muestra de acuerdo con el estándar protocolos Para la inmunoprecipitación, las perlas recubiertas se incubaron durante la noche a 4 °C en un rotador con 100 µl de suero de minipig diluido 1:2 en PBS. Después de los pasos de lavado posteriores, los anticuerpos IgG1 humanos o Ig κ humanos precipitados se eluyeron calentándolos a 95 °C durante 10 min con tampón de muestra Laemmli 2x (BioRad) y se cargaron directamente en geles mini-PROTEAN TGX (4–20 %, BioRad) . El suero de minicerdo de tipo salvaje enriquecido con 100 ng de anticuerpo humano IgG1κ sirvió como control positivo y SeeBlue Plus2 (Invitrogen) junto con MagicMark XP (Invitrogen) sirvió como marcador de peso molecular. Después de la separación por electroforesis, las muestras se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (iBlot, Invitrogen). Después de bloquear con leche descremada en polvo al 5% en solución salina tamponada con Tris-Tween (TBST), las membranas se probaron con peroxidasa de rábano picante (HRP) 1:5,000 de cabra antihumano IgG H+L (policlonal, Jackson) o HRP de ratón 1:10,000. Ig κ antihumana (clon EPR5367-8, Abcam) y desarrollado con sustrato SuperSignal West Femto (Thermo Fisher).41,42

Para la cuantificación de IgG humana, se recubrieron placas Nunc MaxiSorp ELISA (Invitrogen) con 1 μg ml−1 de IgG antihumana de conejo H+L (policlonal, OriGene) en tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 0,1 M pH 9,6, Alfa) a 4 ° C durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % antes de bloquear con PBS que contenía BSA al 2 % (Thermo Fisher) durante 1 h. Se prepararon diluciones en serie de muestras de suero de minipig o IgG1k humana purificada como control positivo en PBS + FBS al 1 % y se incubaron en las placas de ELISA lavadas durante 2,5 ha temperatura ambiente. Después del lavado posterior, la IgG humana unida se sondeó durante 1 h a temperatura ambiente usando HRP anti-IgG humana (clon G18-145, BD), se lavó y luego se reveló usando sustrato Ultra TMB-ELISA (Thermo Fisher). La reacción se detuvo después de 5 min utilizando ácido sulfúrico 0,18 M (Merck Millipore) y se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm utilizando el lector de placas VersaMax ELISA. Los valores de DO de cuatro curvas estándar se interpolaron para calcular la concentración de IgG1 humana en el suero.

Para detectar la presencia de proteínas IgG completamente humanas o híbridas porcinas/humanas, se realizó ELISA como se describe anteriormente con los siguientes anticuerpos: (1) recubrimiento con Ab específico de cabra F(ab')2 anti-cadena ligera κ humana (LC) ( policlonal, Sigma-Aldrich) y detección con un Ab de cadena pesada (HC) anti-IgG humana marcado con HRP (clon G18-145, BD) (para reconocimiento de IgG humana); y (2) recubrimiento con Ab específico de Ig κ LC anti-humano de ratón (clon G20-361, BD) y detección con un IgG HC anti-porcino de ratón marcado con HRP (clon 1G5H7, ProSci) (para el reconocimiento de anticuerpos IgG porcinos/humanos). ).

Minicerdos transgénicos IgG humanos y minicerdos WT Göttingen de ambos sexos fueron inmunizados uno al lado del otro con siete inyecciones subcutáneas dos veces por semana del antígeno diluido en PBS. Los antígenos se administraron en las siguientes dosis: KLH 20 mg kg−1; bevacizumab, daratumumab, cergutuzumab amunaleukina y atezolizumab 0,4 mg kg−1 de peso corporal.

Se extrajeron muestras de sangre el día 0 (sin tratamiento previo) ya intervalos semanales durante 4-5 semanas antes de las inyecciones. La sangre se recogió en tubos Z-Gel de suero (Sarstedt), se dejó coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se centrifugó.

Para la detección de ADA, las placas ELISA se recubrieron con 5 μg ml−1 del antígeno que se usó para la inmunización o fragmentos del mismo como se describe anteriormente. Las muestras de suero diluidas en serie (1:50, luego 1:3 para un total de 8 diluciones) se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente y se detectó la unión de ADA mediante 1 h de incubación con AffiniPure cabra anti-IgG porcina acoplada con fosfatasa alcalina ( H+L) (policlonal, Jackson) anticuerpo de detección. Posteriormente, las placas ELISA se revelaron durante 10 min con fosfato de p-nitrofenilo (Merck Millipore) antes de leer la DO a 405 nm.

Para el cálculo de los títulos de ADA IgG, se determinó un valor de corte para cada estudio sobre la base de la DO media en una dilución 1:50 de todas las muestras naïve multiplicada por su desviación estándar de 6 veces. Los valores atípicos de referencia se determinaron más allá de 1,5 veces el rango intercuartílico del cuartil 3 y se excluyeron. Los valores de DO de las muestras de suero tituladas se ajustaron utilizando el polinomio de quinto grado y los títulos se determinaron mediante la intersección de esta curva con el umbral determinado. Todos los títulos por encima del umbral arbitrario de 200 se determinan como positivos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Los datos fuente para las cifras se proporcionan con este documento. Los conjuntos de datos sin procesar y analizados generados durante el estudio están disponibles a pedido de los autores correspondientes. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a L. Petersen y R. Moser por su apoyo experimental, a G. Steiner por los cálculos de títulos y a C. Klein y S. Klostermann por sus útiles aportes sobre la reactividad cruzada de anticuerpos. Además, agradecemos a PJ Knuckles, A. Kiialainen y U. Nelböck-Hochstetter por iniciar la secuenciación de VDJ, y a A. Greiter-Wilke y EM Amen por el continuo apoyo veterinario y organizativo. Este trabajo fue financiado por F. Hoffmann-La Roche Ltd.

Los siguientes autores contribuyeron por igual: Tatiana Flisikowska, Jerome Egli, Angelika Schnieke y Antonio Iglesias.

Departamento de Ciencias Moleculares de la Vida, Cátedra de Biotecnología Pecuaria, Escuela de Ciencias de la Vida Weihenstephan, Universidad Técnica de München, Freising, Alemania

Tatiana Flisikowska, Krzysztof Flisikowski, Marlene Stumbaum y Angelika Schnieke

Roche Pharmaceutical Research and Early Development, Centro de Innovación de Roche en Basilea, Basilea, Suiza

Jerome Egli, Erich Küng, Martin Ebeling, Roland Schmucki, Thomas Singer, Felix Weber y Antonio Iglesias

Roche Pharmaceutical Research and Early Development, Roche Innovation Center Munich, Penzberg, Alemania

chico jorge

Centro de Genes y Departamento de Ciencias Veterinarias, Cría Animal Molecular y Biotecnología, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Alemania

Mayuko Kurome, Barbara Kessler, Valeri Zakhartchenko y Eckhard Wolf

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AI, TS, AS y TF contribuyeron a la concepción y el diseño del estudio. JE, TF, AI y AS escribieron el documento. TF, KF, MS, MK, BK, VZ, EW, JE y EK realizaron los experimentos. JE, TF, AS, AI, FW, ME, RS y GG analizaron e interpretaron los datos. Todos los autores proporcionaron comentarios activos y valiosos sobre el manuscrito.

Correspondencia a Felix Weber o Angelika Schnieke.

JE, EK, ME, RS, GG, TS, FW y AI son empleados de F. Hoffmann-La Roche Ltd. Los otros autores declaran no tener intereses en conflicto.

Nature Biomedical Engineering agradece a John Hammond, Bernd Jilma y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Se realizó un ELISA sándwich de doble anticuerpo con suero aislado de minicerdos transgénicos F0 (n = 4), F1 (n = 4) y F2 (n = 4). El suero humano (Sigma-Aldrich) (diluido 1:100) y el de tipo salvaje (WT, n = 10) sirvieron como muestras de control. a, La presencia de proteína IgG1 completamente humana (recubrimiento: Ab específico de la cadena ligera (LC) κ anti-humana de cabra, detección: Ab de la cadena pesada (HC) de IgG anti-humana marcada con HRP) en suero aislado de minicerdos transgénicos b, ELISA para detectar IgG híbrido porcino/humano (recubrimiento: Ab específico de LC de Ig κ LC anti-humano de ratón, detección: HC de IgG anti-cerdo de ratón) mostró cierta reactividad cruzada con LC porcino que condujo a una señal positiva en minipigs WT y TG. Sin embargo, una detección con IgG HC anti-cerdo de ratón no aumentó significativamente la señal en los minipigs transgénicos, lo que indica la expresión de proteínas IgG totalmente humanas. El análisis estadístico se realizó mediante el análisis de varianza unidireccional ordinario (ANOVA) y la prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak; p = valor P, ns = no significativo, las barras de error representan la desviación estándar. Cada punto de datos representa una réplica biológica.

Datos fuente

Figuras y tablas complementarias.

Transferencias occidentales sin recortar para la Fig. 2a.

Los datos fuente para las Figs. 2a y 3–5, y para datos extendidos Fig. 1.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Flisikowska, T., Egli, J., Flisikowski, K. et al. Un modelo de minipig humanizado para la prueba toxicológica de anticuerpos recombinantes terapéuticos. Nat. biomedicina Inglés 6, 1248–1256 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00921-2

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Recibido: 15 julio 2021

Aceptado: 01 julio 2022

Publicado: 22 septiembre 2022

Fecha de emisión: noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00921-2

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