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Apr 30, 2023

Estructura y mecanismo del transportador de oxalato OxlT en un oxalato

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1730 (2023) Citar este artículo

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Una bacteria que degrada el oxalato en la microbiota intestinal absorbe el oxalato derivado de los alimentos para usarlo como fuente de carbono y energía, lo que reduce el riesgo de formación de cálculos renales en los animales huéspedes. El transportador bacteriano de oxalato OxlT capta selectivamente oxalato del intestino a las células bacterianas con una discriminación estricta de otros carboxilatos de nutrientes. Aquí, presentamos estructuras cristalinas de OxlT unido a oxalato y libre de ligando en dos conformaciones distintas, estados ocluidos y orientados hacia afuera. El bolsillo de unión al ligando contiene residuos básicos que forman puentes salinos con oxalato mientras previenen el cambio conformacional al estado ocluido sin un sustrato ácido. El bolsillo ocluido puede acomodar oxalato pero no dicarboxilatos más grandes, como intermediarios metabólicos. Las vías de permeación desde el bolsillo están completamente bloqueadas por extensas interacciones entre dominios, que pueden abrirse únicamente mediante un giro de una sola cadena lateral vecina al sustrato. Este estudio muestra la base estructural subyacente a las interacciones metabólicas que permiten una simbiosis favorable.

El oxalato es el dicarboxilato más pequeño (C2O42–) ingerido a través de nuestra dieta diaria a partir de alimentos que contienen oxalato1, como verduras, frijoles y nueces2. El oxalato también es un producto metabólico final en nuestro cuerpo y se secreta en parte al intestino a través de la circulación sistémica1. Luego se absorbe en el tracto intestinal y se excreta a través del riñón3. Sin embargo, el exceso de oxalato forma una sal insoluble con el calcio en la sangre y causa la enfermedad de cálculos renales (Fig. 1a). Oxalobacter formigenes es una bacteria que degrada el oxalato en el intestino4 que puede descomponer metabólicamente el oxalato intestinal y, por lo tanto, contribuye significativamente a la homeostasis del oxalato en los animales huéspedes, incluidos los humanos3,5,6. De hecho, se sabe que los pacientes con fibrosis quística7 o enfermedad inflamatoria intestinal8 o aquellos que se han sometido a una cirugía de derivación yeyunoileal9 tienen bajas tasas de colonización de O. formigenes y un mayor riesgo de hiperoxaluria y formación de cálculos renales.

a Dibujo esquemático de la función OxlT en la bacteria que degrada el oxalato, O. formigenes, en el intestino. b, c Estructuras cristalinas de OxlT unido a oxalato (PDB ID 8HPK; b) y sin ligando (PDB ID 8HPJ; c). d Superposición de OxlT unido a oxalato y sin ligando. Se muestran una vista desde el periplasma (arriba) y dos vistas en el plano transmembrana (abajo). e, f Mapa de potencial electrostático superficial de OxlT unido a oxalato (e) y libre de ligando (f). Los potenciales electrostáticos a ±5 kTe−1 se mapearon en las superficies.

El transportador de oxalato (OxlT), un antiportador de oxalato:formiato (OFA)10 en O. formigenes, es una molécula clave para el metabolismo del oxalato en esta bacteria. OxlT cataliza el antipuerto de carboxilatos a través de la membrana celular según sus gradientes electroquímicos con una especificidad de sustrato optimizada para el dicarboxilato C2, oxalato. De hecho, el transportador muestra una alta tasa de rotación (>1000/s) para el autointercambio de oxalato11,12. En condiciones fisiológicas en el autótrofo de oxalato O. formigenes, la función de intercambio de carboxilato de OxlT permite la absorción de oxalato del intestino del huésped como única fuente de carbono para la bacteria y la liberación de formiato (HCO2–), el producto de degradación final del oxalato. que es tóxico si se acumula en la célula bacteriana11,12,13 (Fig. 1a). El recambio catalítico de OxIT del intercambio de oxalato:formiato se acompaña de la degradación metabólica del oxalato a formato a través de una descarboxilasa que consume un protón en el citosol, lo que produce un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana celular bacteriana11. Por lo tanto, OxlT sirve como una 'bomba de protones virtual' que crea una fuerza motriz de protones para la síntesis bacteriana de ATP11. Por lo tanto, las características funcionales de OxlT como antiportador entre oxalato y formiato, en lugar de uniportador de cada químico, son esenciales para acoplar el metabolismo del carbono y la formación de energía. En particular, OxlT no acepta oxaloacetato (C4H2O52-) o succinato (C4H4O42-), que son dicarboxilatos intermedios del ciclo de Krebs, como sustratos13. Estos dicarboxilatos con cuatro átomos de carbono (dicarboxilatos C4) son intermediarios metabólicos importantes en el lado citosólico bacteriano, mientras que también se absorben como fuentes de energía y precursores biosintéticos a través de un transportador intestinal en el lado del lumen del huésped14. Por lo tanto, la capacidad de OxlT para discriminar entre dicarboxilatos C2 y C4 es fundamental para la simbiosis favorable entre los animales huéspedes y la bacteria intestinal.

OxlT pertenece a la superfamilia de facilitadores principales (MFS), la gran familia de transportadores cuyos miembros transportan una amplia gama de productos químicos10. Las proteínas MFS comparten una arquitectura común de doce hélices transmembrana (TM) que contienen mitades N- y C-terminales simétricas de seis unidades de TM con duplicación de genes, con un sitio de unión al sustrato en el centro de la molécula15,16. El mecanismo de transporte de sustrato de la familia MFS, así como de otras familias de transportadores, se explica por el 'modelo de acceso alterno'17, mediante el cual las moléculas transportadoras abren una cavidad desde el sitio de unión a cualquier lado de la membrana alternativamente, y toman hacia afuera, conformaciones ocluidas y orientadas hacia adentro a través de un movimiento de "interruptor basculante" de los dominios N- y C-terminal, lo que permite la transferencia de sustrato a través de la membrana18,19,20. Aunque se ha acumulado una gran cantidad de información estructural de cada miembro de MFS, el conocimiento actual sobre la familia OFA sigue estando limitado a una estructura OxlT resuelta inicialmente por cristalografía electrónica a 6,5 ​​Å21,22. Por lo tanto, el mecanismo específico de reconocimiento de oxalato y antipuerto de OxlT aún debe dilucidarse en una estructura de mayor resolución.

En este estudio, informamos las estructuras cristalográficas de rayos X de OxlT en formas unidas a oxalato y sin ligando resueltas a 3.0–3.3 Å para comprender la base estructural de estas funciones transportadoras clave que subyacen a la simbiosis de esta bacteria degradadora de oxalato en la tripa.

El OxlT de tipo salvaje es inestable en diversas condiciones, como en presencia de iones de cloruro12,23, lo que reduce significativamente el espacio químico disponible para el cribado de cristalización. Para el estudio estructural de OxlT, se adoptó una estrategia de cristalización asistida por anticuerpos. En general, los fragmentos de anticuerpos Fab o Fv que se unen específicamente a epítopos conformacionales en proteínas de membrana pueden aumentar el área superficial hidrófila disponible para la formación de redes cristalinas rígidas. Además, los fragmentos de anticuerpos unidos pueden reducir la flexibilidad inherente de la proteína y la heterogeneidad conformacional, lo que aumenta la probabilidad de cristalización exitosa de las proteínas de membrana24,25. OxlT se estabilizó mediante la unión de dos fragmentos de anticuerpos diferentes, lo que dio como resultado la cristalización en dos condiciones diferentes. Confirmamos que los fragmentos de anticuerpos utilizados para la cristalización se unen a OxlT tanto en presencia como en ausencia de oxalato (Fig. 1 complementaria). Por lo tanto, es poco probable que los fragmentos de anticuerpo atrapen artificialmente OxlT en una conformación particular. La estructura cristalina de OxlT unido a oxalato en complejo con el fragmento Fab se resolvió a 3,0 Å (PDB ID 8HPK), mientras que la de OxlT sin ligando en complejo con un fragmento Fv se resolvió a 3,3 Å (PDB ID 8HPJ) (Figura complementaria .2a, b y tablas complementarias 1 y 2).

La estructura general de OxlT consta de 12 hélices TM (Fig. 1b, c), como se observó en la estructura EM anterior21 y luego se confirmó como una arquitectura MFS típica15,16. En el estado unido a oxalato, la proteína OxlT adopta una conformación ocluida con una molécula de oxalato unida en el centro de la estructura (Fig. 1b, e). Por el contrario, el OxlT sin ligando toma una conformación sustancialmente diferente de la forma unida al oxalato (Fig. 1c, d, f). La proteína OxlT muestra una gran cavidad en forma de V entre los dominios N- (TM1-6) y C-terminal (TM7-12), que está conectada desde el sitio de unión del oxalato central al periplasma, una firma clara de un exterior. -Conformación enfrentada.

En una comparación de las estructuras ocluidas y orientadas hacia afuera, la desviación cuadrática media (RMSD) de Cα para todos los residuos fue de 2.6 a 2.7 Å (Fig. 1d). Incluso los únicos dominios N- o C-terminal de los dos mostraron diferencias estructurales considerables (Cα RMSD de ~1.5–1.6 Å). Por lo tanto, el cambio estructural entre los estados ocluido y orientado hacia el exterior con un movimiento de 'interruptor basculante' no se logra mediante la inclinación de las unidades estructurales rígidas, sino que es concomitante con su flexión. De hecho, se observan curvas conspicuas en la porción periplásmica en TM1, 2, 4, 7, 8 y 11 en la estructura que mira hacia afuera, con inclinación de las otras hélices TM circundantes (Fig. 1d). Por el contrario, no hubo diferencias notables en la porción citoplasmática entre las dos conformaciones. En otras proteínas MFS, como GLUT5 y NarK, se ha observado la flexión de los residuos de glicina en las hélices TM entre los diferentes estados conformacionales26,27. OxlT tiene 52 residuos de glicina, que es aproximadamente una octava parte (12,4%) del contenido de aminoácidos (Fig. 1d, Figs. complementarias 2c, d y 3). En particular, esta frecuencia de glicina es más alta que la de otras proteínas MFS, como LacY (8,6 %), GLUT5 (7,6 %) o NarK (10,4 %), y en hélices TM en otras proteínas de membrana (~8,7 %)28. Por lo tanto, la acumulación de flexión de las hélices TM en los residuos de glicina parece más prominente para lograr el cambio conformacional entre los estados en OxlT. También se encontraron residuos de glicina en la interfaz entre los dominios N- y C-terminal como en TM5 y TM8 o TM2 y TM11 (Fig. 2c, d complementaria) y lograron un empaquetamiento helicoidal ajustado como se informó anteriormente28,29. La alta presencia de glicina observada en OxlT puede ser necesaria para ocluir el oxalato, que es pequeño para un sustrato transportado, en el centro de la molécula. Por el contrario, la arquitectura rica en glicina probablemente sea responsable de la inestabilidad de OxlT en las micelas detergentes, lo que dificulta la cristalización en ausencia de fragmentos de anticuerpos y ensayos funcionales, como se describe a continuación. La alta proporción de glicina también se observó en las otras proteínas OFA (10.2 ± 1.1% con 15 posiciones estrictamente conservadas; observada en 11 miembros de la familia que se muestran en la Fig. 3 complementaria) y puede ser un rasgo familiar.

En la estructura cristalina (PDB ID 8HPK), la molécula de oxalato que se une a OxlT se refina como una configuración retorcida (Fig. 2a y Fig. 4a complementaria). Se sabe que el enlace entre los dos grupos carboxilo en un dianión de oxalato es simple y no conjugado, lo que permite una rotación libre de los grupos carboxilo alrededor del enlace CC30. Dado que la resolución de la estructura OxlT unida al oxalato es insuficiente para determinar con precisión el ángulo diedro del oxalato, realizamos cálculos de mecánica cuántica (QM) y mecánica cuántica/mecánica molecular (QM/MM) de la unión del oxalato en la estructura OxlT ocluida para examinar la conformación minimizada energéticamente. Los ángulos diedros de OCCO resultantes en el oxalato estaban dentro de 50–68˚ (Figura complementaria 4b, c y Tabla complementaria 3). Estos valores son cercanos a los observados en la estructura cristalina original (60.1˚), verificando que el oxalato no es plano sino torcido en la estructura cristalina.

a Primer plano del sitio de unión en OxlT unido a oxalato (PDB ID: 8HPK). Las líneas discontinuas indican posibles enlaces de hidrógeno y puentes salinos. También se muestra una vista ampliada de la molécula de oxalato unida con etiquetas de átomos. b Superposición de las estructuras del sitio de unión al sustrato de OxlT (con las etiquetas subrayadas) y NarK (verde, con etiquetas normales; PDB ID: 4U4W) según la similitud topológica de los residuos de aminoácidos que interactúan con los sustratos. c Ensayo de unión de oxalato por GFP-TS. Los datos representan medias ± SEM de los aumentos en las temperaturas de fusión provocados por la adición de oxalato de potasio 3 mM en tres experimentos independientes. WT: tipo salvaje. d Ensayo de captación de oxalato utilizando células recombinantes de E. coli. Se muestran las actividades de transporte relativas del OxlT mutante con respecto al OxlT WT medido el mismo día establecido como 100 %, mientras que el de las células sin expresar OxlT36 se estableció como 0 %. Las barras representan los medios de las mediciones técnicamente duplicadas de un solo experimento para cada mutante. Los resultados de los mutantes R272A y K355Q se vuelven a publicar del estudio anterior36 para comparar. e Ensayo de captación de oxalato de proteoliposoma. Las concentraciones de oxalato resultantes en los lisados ​​de liposomas se midieron y normalizaron a las del WT OxlT a los 60 min. Los resultados de los liposomas sin OxlT se muestran como "vacíos". Las barras representan las medias de los resultados en tres (datos a 0 min y 60 min para vacío, WT y R272A) o dos (otros) experimentos independientes. au: unidad arbitraria. En los paneles c y e, los datos se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional de dos lados con la prueba de Dunnett con el WT OxlT como control, y los valores de P exactos se proporcionan en la Tabla complementaria 6. * P < 0.05, * *P < 0,01, ***P < 0,001. Las barras rojas indican los mutantes (o mutaciones en el mismo residuo) que muestran una pérdida de actividad en estudios previos31,32,34. f Interacciones entre dominios que cierran la cavidad al citoplasma. g Red de interacción iónica en el lado citoplasmático de OxlT. h Interacciones entre dominios que cierran la cavidad al periplasma.

En el sitio de unión en OxlT, el oxalato se une al transportador con un grupo carboxilo formando un puente salino bidentado con Arg272 en TM8 mientras que el otro forma una interacción iónica con Lys355 en TM11 (Fig. 2a). Además del puente salino con el oxalato, el grupo ε-amino en Lys355 forma una red de enlaces de hidrógeno entre dominios con los grupos carboxamida en Gln34 (TM1) y Gln63 (TM2) en el dominio N-terminal. De manera similar, el grupo guanidino en Arg272 forma un enlace de hidrógeno entre dominios con el grupo carbonilo de cadena principal en Ala147 (TM5) y además interactúa con la carboxamida de cadena lateral y el grupo carbonilo de cadena principal de Asn268 aguas arriba de TM8. La región alrededor de Arg272 es el punto de flexión en TM8 debido a la secuencia de N268GGCR272P y, por lo tanto, los enlaces de hidrógeno entre Arg272 y Asn268 probablemente mantienen la conformación y orientación de TM8 en la estructura unida al oxalato. Estas redes de enlaces de hidrógeno entre dominios e intradominios que involucran a Arg272 y Lys355 probablemente desempeñen un papel fundamental en la organización de la estructura del bolsillo de unión y la estabilización de la conformación ocluida, a pesar de la ubicación de estos dos residuos básicos dentro del dominio C-terminal. Estos dos residuos básicos se conservan dentro de la familia OFA (Fig. 3 complementaria), son esenciales para el transporte de oxalato e incluso las mutaciones R272K o K355R reducen la actividad de transporte31,32,33. Estos resultados confirman las observaciones de que no solo las cargas sino también las estructuras químicas de las cadenas laterales de los dos residuos son importantes para la organización estructural del sitio de unión.

Además de los dos residuos básicos, se encuentra que numerosos residuos aromáticos contribuyen a la unión del oxalato. Los grupos hidroxilo de Tyr35 y Tyr124 forman enlaces de hidrógeno con cualquiera de los grupos carboxilo en oxalato (Fig. 2a). Además, los grupos de la cadena lateral aromática en Tyr150, Trp324, Tyr328 y Trp352 forman interacciones π-π cara a cara o borde a cara con los grupos carboxilo en el oxalato, lo que indica la importancia de los sistemas de electrones π en el oxalato para reconocimiento molecular por OxlT. Estos residuos aromáticos distribuidos en las mitades N- y C-terminal y, por lo tanto, sus interacciones con el oxalato también estabilizan el cierre de las cavidades entre dominios para lograr la conformación ocluida. Además, Trp352 (TM11) forma un enlace de hidrógeno entre dominios con Gln66 (TM2). Estos residuos aromáticos se conservan entre las proteínas que pertenecen a la familia OFA (Fig. 3 complementaria). De hecho, las mutaciones en Tyr150 o Trp352 se han relacionado con la pérdida de funciones de transporte en estudios previos31,34. En particular, se observó una combinación similar de interacciones iónicas y π-π con el reconocimiento de nitrato, que también tiene un sistema de electrones π, por parte de NarK en la familia de nitrato/nitrito porter (NNP)26,29, aunque la familia NNP es distante de la familia OFA10 y las posiciones de los residuos involucrados no se corresponden entre sí (Fig. 2b).

Se investigó la importancia de los residuos mencionados anteriormente o sus vecinos para la unión y el transporte de oxalato. Dado que el OxlT purificado es inestable, particularmente en ausencia de sustrato, utilizamos una variedad de ensayos funcionales: (1) el ensayo de desplazamiento térmico de GFP (GFP-TS)35 para evaluar la capacidad de unión de oxalato, utilizando el crudo solubilizado con detergente proteína de fusión OxlT-GFP que contiene lípidos de las células huésped de E. coli; (2) un ensayo de transporte en celulo usando células de E. coli que expresan OxlT36 de manera recombinante; y (3) un ensayo de transporte in vitro utilizando proteoliposomas reconstituidos con OxlT purificado. En el ensayo GFP-TS, OxlT de tipo salvaje exhibió estabilización térmica tras la unión de oxalato. Por el contrario, el grado de estabilización térmica dependiente de oxalato se redujo en las proteínas OxlT mutantes Q34A, Y35A, Y124A, Y150A, N268A, R272A, W324A y K355Q (Fig. 2c). Dado que las termoestabilidades de las proteínas OxlT mutantes no fueron significativamente diferentes de las de OxlT de tipo salvaje en ausencia de oxalato (Fig. 5 complementaria), estos resultados sugirieron que la mutación en los residuos resultó en una afinidad de unión reducida de oxalato y/o o reducción de la estabilidad de la estructura unida. En el ensayo de transporte en celulo, se evaluó el grado de intercambio de oxalato-formiato por parte de OxlT en células de E. coli, que es negativamente electrogénico, mediante la transferencia de protones hacia el interior impulsada por luz acoplada por una xenorrodopsina coexpresada y el aumento de pH resultante de la solución externa36 (fig. 2d). Además de los mutantes no funcionales R272A y K355Q31,32, cuya pérdida de actividad se había verificado en nuestro estudio previo36, las mutaciones OxlT con Q34A, Y35A, N268A, W324A, Y328A y W352A también redujeron la actividad (fig. 2d). Finalmente, se realizó el ensayo de transporte in vitro usando el OxlT purificado reconstituido en proteoliposomas para R272A y los mutantes que no han sido probados por este método en los estudios previos (Fig. 2e y Fig. 6 complementaria). Se observó una tendencia similar entre los ensayos de proteoliposoma y de celuloide, a pesar de algunas pequeñas desviaciones debidas a las diferencias en los dos sistemas. Curiosamente, mientras que la mayoría de los mutantes demostraron una disminución tanto en las actividades de unión como de transporte, las mutaciones Y124A y W324A no tuvieron efectos significativos en las actividades de transporte, al menos en cualquiera de los ensayos de transporte, a pesar de la capacidad de unión de oxalato reducida. Estas observaciones pueden explicarse por el hecho de que la disminución de la afinidad puede dar como resultado una aceleración de la captación neta debido a la compensación de la tasa de afinidad y/o la reducción del flujo de salida del sustrato37. Por el contrario, Y328A y W352A mostraron una unión de oxalato similar pero actividades de captación de oxalato reducidas en comparación con el OxlT de tipo salvaje, lo que indica la importancia de estos residuos en el recambio catalítico. Por lo tanto, los resultados de los estudios funcionales sugirieron que los residuos en la vecindad del oxalato unido en la estructura OxlT juegan un papel importante en la unión y/o el transporte de oxalato.

Las interacciones entre el sustrato y los residuos en la estructura cristalina OxlT ocluida están optimizadas para el oxalato de dicarboxilato C2. Dado que la molécula de oxalato se ajusta firmemente al bolsillo de unión, reemplazar el oxalato con un dicarboxilato más grande, como los intermedios del ciclo de Krebs, provoca choques estéricos con los residuos en OxlT, lo que probablemente desestabiliza la conformación ocluida (Fig. 7a complementaria). Un estudio de acoplamiento flexible dio como resultado una posición que podía acomodar un dicarboxilato C3, malonato, en el sitio de unión del OxlT ocluido, aunque esto tenía menos interacciones en comparación con el caso del oxalato, debido a la reorganización de los residuos de aminoácidos en el bolsillo de unión. (Fig. 7b complementaria). Esto es coherente con la disminución de la afinidad y la actividad de transporte del malonato con un valor de Kd de 1,2 mM en comparación con 0,02 mM para el oxalato13. Incluso con el acoplamiento flexible, no se observó ninguna posición para la unión de los dicarboxilatos C4 al OxlT ocluido, lo que concuerda con un informe anterior que indica que estas moléculas no compiten significativamente con el oxalato por la absorción por OxlT13. El ensayo GFP-TS confirmó la mayor especificidad de oxalato para OxlT; la estabilización térmica de OxlT se observó de manera prominente en presencia de oxalato (C2) pero no en presencia de malonato (C3) o succinato (C4) (Fig. 7c complementaria).

Desde el sitio de unión del oxalato hasta el citoplasma o el periplasma, se observaron amplias interacciones intramoleculares entre las hélices TM en los dominios N- y C-terminal, como TM2 y TM11, TM5 y TM8, las mitades periplásmicas de TM1 y TM7, y el mitades citoplasmáticas de TM4 y TM10 (Fig. 2f-h). Estas interacciones estabilizan el cierre de las cavidades entre dominios en la estructura ocluida.

En el lado citoplásmico debajo del sitio de unión del oxalato, se observaron interacciones hidrofóbicas que involucran a Met128 (TM4), Pro332 (TM10) y Tyr348 (TM11), seguidas de interacciones polares entre Asn129 (TM4) y Ser344 (TM11), Arg133 (TM4) y los grupos carbonilo de la cadena principal de Thr341 y Ala342 (TM11) (Fig. 2f). Estas interacciones están respaldadas por interacciones de carga-dipolo en el extremo citoplásmico, formadas entre Asp78 (TM2) o Asp280 (TM8) y los extremos N-terminales de TM11 o TM5, respectivamente (Fig. 2g). Los dos residuos de aspartato están ubicados en los motivos 'similares a A' en las regiones TM2-3 (secuencia 'G74YFVD78KFGP82R83IP', AL2-3) o TM8-9 (G276FVSD280KIGR284YK, secuencia, AL8-9) (Fig. 3 complementaria). El motivo A es uno de los motivos comúnmente conservados en las proteínas MFS, y se sabe que el D (+ 5) participa en interacciones dipolo carga-hélice entre dominios38. En particular, estos residuos de aspartato componen además extensas redes de interacción iónica en el lado citoplasmático (Fig. 2g). Específicamente, Asp78 y Arg133 en TM4, y el residuo aguas abajo Asp137 y Arg16 en TM1, forman puentes salinos. Más abajo, Arg139 en el extremo N-terminal de TM5 forma una red de retransmisión de carga con Asp337, Arg284 y Asp280.

En el lado periplásmico por encima del sitio de unión del oxalato, un enlace de hidrógeno entre Thr38 (cadena lateral) en TM1 y Val240 (esqueleto) en TM7 (2,72 Å) cierra el túnel del poro en la conformación ocluida (Fig. 2h). Por encima del enlace de hidrógeno, Leu39 (TM1), Leu52 (TM2), Val244 y Pro245 (TM7) y Val261 (TM8) forman interacciones hidrofóbicas.

En contraste con el sitio de unión al sustrato ocluido en el OxlT unido a oxalato, una gran cavidad desde el sitio de unión hasta el espacio periplásmico está abierta en el OxlT sin ligando (PDB ID 8HPJ; Fig. 1f). En el sitio de unión vacío, la cadena lateral Lys355 se sale de Arg272 debido a la repulsión de la carga y cambia las posiciones de las que se encuentran en la forma unida al oxalato (Fig. 3a). En la forma libre de ligando, se retienen la mayoría de los enlaces de hidrógeno entre dominios observados en el estado unido a oxalato. Sin embargo, el que está entre Lys355 en el dominio C-terminal y Gln34 en el dominio N-terminal probablemente esté interrumpido en el estado libre de ligando, a juzgar por la distancia entre las cadenas laterales (>~4 Å). También se observaron cambios de posición de los residuos aromáticos circundantes, como Tyr35, Tyr150, Trp324 y Tyr328 (Fig. 3b). Estos cambios en el sitio de unión al sustrato debido a la ausencia de oxalato probablemente subyacen a la reorganización estructural de la arquitectura general y dan como resultado el cambio conformacional entre el estado ocluido y el que mira hacia afuera. En particular, la cavidad que se abría al periplasma mostraba una extensa superficie cargada positivamente (Figs. 1f y 3c). Esta propiedad básica se deriva principalmente de Arg272 y Lys355 en el sitio de unión. Además, los grupos amino de cadena lateral en Lys45 y Arg248 y los grupos amida en Gln34, Asn42, Gln56, Asn264, Asn265 y Asn268, que recubren esta cavidad, ahora están expuestos al solvente. Estos grupos y los momentos dipolares positivos de las hélices dobladas de TM1, TM5 y TM11 también contribuyen a la propiedad básica de toda la cavidad (Fig. 3c). La repulsión de carga provocada por Arg272 y Lys355 en el sitio de unión al ligando vacío, así como la extensa superficie básica de la cavidad, probablemente impide el cierre de la bolsa a la forma ocluida en ausencia de oxalato, estabilizando así un estado abierto. La estabilidad de una conformación en estado abierto en ausencia de sustrato, que impide la transición al estado ocluido, subyace a la función de OxlT como antiportador, en la que el cambio conformacional en ausencia de sustrato durante el proceso catalítico no está permitido22,38. Se observó una situación similar en un antiportador NarK29 de nitrato/nitrito, donde la superficie cargada positivamente de la cavidad abierta estabilizó la conformación orientada hacia adentro26.

a Primer plano del sitio de unión en OxlT sin ligando (PDB ID: 8HPJ) visto desde la misma orientación en la Fig. 2a. El código de colores del dominio es como en la Fig. 1c. Las líneas discontinuas indican posibles enlaces de hidrógeno. b Superposición de las estructuras del sitio de unión al sustrato de OxlT en formas unidas a oxalato y sin ligando. c Primer plano de la cavidad abierta al periplasma. También se muestran modelos de residuos polares expuestos a la cavidad y la superficie coloreada con el mapa de potencial electrostático a ±5 kTe−1. En los paneles a–c, la molécula definida como cadena A se muestra como representante.

Por otro lado, la parte citoplásmica de la estructura OxlT sin ligando no muestra cambios significativos con respecto a la estructura unida al oxalato (Fig. 1d).

Para abordar la dinámica estructural de OxlT que permite el cambio conformacional necesario para el ciclo de transporte, realizamos simulaciones de dinámica molecular (MD)39 basadas en las estructuras cristalinas de OxlT ocluidas unidas al oxalato y libres de ligandos que miran hacia afuera.

Primero simulamos la unión de oxalato a la conformación orientada hacia afuera sin ligando (PDB ID 8HPJ) colocando el oxalato fuera de la proteína (Fig. 4a-c y Fig. 8 complementaria). En Gln34, Tyr35, Arg272, Tyr328 y Lys355, se observó la unión del ion oxalato al sitio de unión de OxlT (Fig. 4b). La distancia entre los centros geométricos del ion oxalato y los residuos del sitio de unión, con una distancia de corte de 5 Å, determinó la unión (Fig. 4c). La interacción del ion oxalato con Lys355 resolvió su repulsión de carga con Arg272 en la forma libre de ligando y restauró la configuración de la cadena lateral desde el estado invertido. La unión rápida del ion oxalato cargado negativamente se ve facilitada por una superficie extensa cargada positivamente (Figs. 1f y 3c). La estabilidad de la conformación unida dependía del estado de protonación de Lys355 (ver Métodos para el cálculo de pKa), que puede verse influenciado por el pH luminal en el intestino, que varía de 5 a 8 por región40, y el ambiente hidrofóbico en el sitio de unión41 . Para el Lys355 protonado, se observó un solo evento de unión, y el ion oxalato unido permaneció principalmente en el sitio de unión durante el resto de la simulación (línea gris en el panel superior de la Fig. 4c). Por el contrario, para el Lys355 neutro, se observaron múltiples eventos de unión y desunión de diferentes iones de oxalato (líneas coloreadas en el panel inferior de la Fig. 4c). Esto da como resultado una mayor tasa de ocupación del 98,6 % para el Lys355 protonado que del 77,0 % para el Lys355 neutro, que se calcula mediante la definición anterior del estado ligado usando el oxalato y la distancia del sitio de ligado. Por lo tanto, se predice una constante de disociación de oxalato más baja para el Lys355 protonado. Durante las simulaciones de 1,7 µs, la conformación orientada hacia el exterior de OxlT fue estable, como se muestra en el gráfico del RMSD de los átomos de la columna vertebral de la estructura cristalina orientada hacia el exterior (Fig. 4a). Los resultados sugieren que la unión del oxalato observada en las simulaciones es un modo de unión de etapa temprana que debe ser seguido por el reordenamiento conformacional y la desolvatación del sitio de unión y la transición a la conformación ocluida para adaptar la conformación completamente unida.

Las simulaciones a-c MD comenzaron a partir de la estructura cristalina OxlT orientada hacia afuera sin ligando (PDB ID 8HPJ). a Los RMSD de la estructura cristalina inicial que mira hacia afuera se muestran para dos trayectorias con diferentes estados de protonación de Lys355 en diferentes colores. b Instantánea del oxalato unido a OxlT con Lys355 protonado. En la instantánea alejada, las moléculas de agua dentro de una distancia de 15 Å del ion oxalato se muestran en color CPK, mientras que las que están entre 15 y 25 Å de distancia se muestran en azul. En la instantánea de primer plano, se muestran las moléculas de agua a una distancia de 15 Å del ion oxalato. c Se muestran las distancias de los iones de oxalato desde el sitio de unión en una sola trayectoria, ya sea con Lys355 protonada (arriba) o Lys355 desprotonada (abajo). Los centros geométricos del ion oxalato y los residuos del sitio de unión se usaron para calcular la distancia. Diferentes colores representan los diferentes iones de oxalato incluidos en la simulación. Las simulaciones de d-f MD comenzaron a partir de la estructura cristalina OxlT ocluida unida al oxalato (PDB ID 8HPK). d Los RMSD de la estructura cristalina ocluida inicial se muestran para tres trayectorias independientes en diferentes colores. e Puertas hidrofóbicas de OxlT. En el panel superior, el número de moléculas de agua dentro de una distancia de 15, 8 y 4 Å del ion oxalato unido se representan en marrón, amarillo y rojo, respectivamente. En el panel inferior, se muestra una instantánea a 1000 ns en las vistas de acercamiento y alejamiento. Las moléculas de agua tienen el mismo color que el panel b. Consulte también la película complementaria 1. f La transición observada de la conformación ocluida a la orientada hacia afuera desencadenada por el giro Gln34. El ion oxalato y los residuos del sitio de unión se muestran en la representación de barras. Gln34 está resaltado con el círculo rojo. Las moléculas de agua se muestran en la representación vdW. Las moléculas de agua tienen el mismo color que el panel b. Las líneas discontinuas entre la cadena lateral Thr38 y la cadena principal Val240 en negro y rojo representan las distancias dentro o fuera del enlace H, respectivamente. Véase también Película complementaria 2.

A continuación, abordamos la dinámica conformacional de la conformación ocluida (PDB ID 8HPK) en el estado unido al oxalato. Durante la simulación de 1 µs, dos de las tres trayectorias independientes permanecieron en estado ocluido (Fig. 4d). En la conformación ocluida, la mayoría de las moléculas de agua se bloquearon en ciertas posiciones en los lados periplásmico y citoplasmático del transportador durante las simulaciones, aunque algunas ingresaron a OxlT (Fig. 4e y Película complementaria 1). Un análisis de la densidad del agua identificó capas estructurales que bloqueaban la entrada de agua en el sitio de unión del oxalato durante la simulación (Fig. 9 complementaria). Uno de estos es una capa hidrofóbica que consta de Thr38 y Leu39 en TM1, Val244 en TM7 y Val261 en TM8 en el lado periplásmico (panel inferior izquierdo de la Fig. 4e). Esta capa, combinada con el enlace de hidrógeno entre Thr38 y Val240 en TM7 (que se muestra con una línea discontinua en el panel inferior izquierdo de la Fig. 4e), también bloqueó la salida del ligando al lado extracelular y, por lo tanto, sirvió como puerta periplásmica. La otra capa consta de Met128 en TM4, Pro332 en TM10 y Tyr348 en TM11 en el lado citoplásmico (panel inferior derecho de la Fig. 4e). Estas puertas hidrofóbicas periplásmicas y citoplásmicas, junto con el enlace de hidrógeno TM1-TM7, tienen similitud con el transportador NarK informado anteriormente42, basado en residuos ubicados en posiciones similares a las de OxlT en la estructura alineada (Fig. 10 complementaria). Este resultado sugiere que las puertas hidrofóbicas39 son un mecanismo conservado entre los dos transportadores.

Por el contrario, en una trayectoria desde la conformación ocluida, se observó una apertura de la puerta periplásmica (línea azul en la Fig. 4d). En la transición, primero se produjo el cambio de la cadena lateral Gln34 desde el sitio de unión (Fig. 4f, Fig. 11a complementaria y Película complementaria 2). El cambio de Gln34 resultó en una interrupción del enlace de hidrógeno con Lys355, como se observa en la estructura cristalina que mira hacia afuera (Fig. 3a). Además, dado que Gln34 se encuentra un giro aguas arriba de Thr38 en TM1, la inversión también provocó una interrupción constante del enlace de hidrógeno entre Thr38 y Val240, que se unía y desconectaba por fluctuación térmica incluso antes de la inversión (mostrado por una línea discontinua en la Fig. 4f y la Fig. 11b complementaria). Después de ~ 280 ns después del cambio de Gln34, OxlT comenzó a abrirse hacia el exterior y muchas moléculas de agua ingresaron al transportador (Fig. 4f y Película complementaria 2). Notamos que el giro Gln34 es una conformación transitoria y que la cadena lateral volvió a la posición original después de alcanzar el estado orientado hacia afuera en la última parte de la simulación, de acuerdo con la observación en la estructura cristalina orientada hacia afuera (Fig. 11a, c). En particular, también se observó el cambio de Gln34 en una trayectoria que comienza desde la conformación ocluida con formiato modelado en el sitio de unión (Fig. 12 complementaria). En esta trayectoria, el enlace de hidrógeno entre Thr38 y Val240 se rompió nuevamente por completo después del cambio de Gln34, seguido de una transición de la conformación ocluida a la orientada hacia afuera, de acuerdo con la reacción fisiológica de la liberación de formiato al periplasma en O. formigenes . Por el contrario, el cambio de Gln34 no se observó en ninguna de las otras trayectorias sin el acompañamiento de la transición conformacional en las formas unidas a oxalato y formiato (Figuras complementarias 11 y 12). Estos hallazgos sugieren que la cadena lateral Gln34, junto con el enlace de hidrógeno entre Thr38 y Val240, funciona como un "cierre de la puerta periplásmica" para evitar la transición de las conformaciones ocluidas a las que miran hacia afuera. De hecho, el mutante Q34A mostró una pérdida parcial de las actividades de unión y transporte en relación con la proteína de tipo salvaje (Fig. 2c-e), lo que indica que la mutación desestabiliza la conformación ocluida. Gln34, junto con Thr38, se conserva estrictamente dentro de la familia OFA (Fig. 3 complementaria).

El ángulo diedro de OCCO del ion oxalato en el sitio de unión ocluido se convirtió en ~ 90 ° después del cambio de Gln34 (Fig. 13a complementaria), que es el valor observado en la solución43. Esto contrasta con las otras dos trayectorias sin el giro Gln34, donde el ángulo diedro del oxalato permaneció alrededor de 40–50 ° (y su posición invertida en 130–140 °; Fig. 13a complementaria), que es similar a las que se encuentran en la estructura cristalina. y los cálculos QM/MM. Curiosamente, los valores observados en el oxalato unido al OxlT que mira hacia afuera durante la simulación se distribuyeron ampliamente con picos dobles a ~ 60 ° y ~ 120 ° (Fig. 13b complementaria), que difieren de los de la solución y bastante más cerca de los en la estructura cristalina ocluida. Estos hallazgos sugieren que el oxalato unido reorganiza su conformación en respuesta al cambio ambiental causado por el cambio conformacional de OxlT y adopta una conformación favorable para el siguiente paso en el ciclo del transportador.

No se observó apertura de la puerta citoplásmica durante la simulación de 1 µs para ninguna de las trayectorias de la conformación ocluida. Esto puede atribuirse a las extensas interacciones entre dominios observadas en el lado citoplásmico, como el motivo A que involucra redes de transmisión de carga (Fig. 2g) que se sabe que estabiliza la conformación orientada hacia el exterior38. Estos resultados sugieren que la transición del estado ocluido al abierto hacia adentro tiene una cinética lenta durante todo el proceso de transporte. Uno de los mutantes enigmáticos que muestra una unión reducida de oxalato pero retiene la actividad de transporte, Y124A (Fig. 2c-e), se ubica en la entrada de la puerta citoplásmica debajo del oxalato unido (Figs. 2f y 4f). La mutación podría desestabilizar la capa hidrófoba en la puerta y facilitar su apertura, probablemente el paso limitante de la velocidad del transporte, y por lo tanto podría compensar la afinidad reducida por el oxalato en su actividad de transporte.

Las dos estructuras cristalinas de OxlT y las simulaciones MD basadas en ellas proporcionaron pistas para comprender el proceso de transporte de acceso alterno de OxlT (Fig. 5). El siguiente proceso se describe según el gradiente electroquímico formado en O. formigenes dentro del intestino. Para el proceso de captación de oxalato, OxlT exhibe una extensa superficie cargada positivamente en la cavidad abierta al periplasma, lo que permite la unión del oxalato ácido al sitio de unión. La superficie cargada positivamente también evita la transición conformacional al siguiente paso de transporte en ausencia del sustrato que es una característica indispensable para un antiportador. Sin embargo, la unión de oxalato neutraliza la carga positiva local y permite el cambio conformacional de la conformación orientada hacia el exterior a la conformación ocluida. Además, las energías libres de unión relativas calculadas de oxalato a OxlT revelaron una estabilización significativa en la conformación ocluida en comparación con la conformación abierta hacia afuera (es decir, una disminución de ~20 kcal/mol), lo que proporciona una base física para el cambio conformacional inducido por el oxalato. unión (consulte la sección "Métodos" y la Tabla complementaria 4). El estado ocluido es un paso esencial para que el transporte sirva como punto de control discriminatorio entre el oxalato y los intermediarios metabólicos necesarios del huésped, como los del ciclo de Krebs, utilizando la restricción de tamaño impuesta por el bolsillo de unión. La conformación ocluida puede eventualmente permitir la apertura de la puerta citoplasmática y la liberación de oxalato al citoplasma.

El paisaje conformacional de OxlT a lo largo de las distancias de las puertas periplásmicas y citoplásmicas se muestra en el panel superior derecho. Las distancias Cα de los residuos de puerta en simulaciones MD de los estados ocluido y abierto hacia afuera y la transición inducida por Gln34 se muestran en rojo, amarillo y azul, respectivamente. También se muestran las distancias puerta-residuo en las estructuras cristalinas actuales ocluidas (PDB ID 8HPK) y orientadas hacia el exterior (PDB ID 8HPJ), así como en la estructura cristalina orientada hacia el interior de Nark (PDB ID 4U4T).

Posteriormente, un formiato que se une al OxlT que mira hacia adentro puede devolver el transportador al estado ocluido. La transición conformacional requerida para regresar de los estados ocluidos a los estados iniciales orientados hacia afuera en el ciclo antipuerto puede lograrse mediante un cambio transitorio de una cadena lateral de un residuo vecino al sustrato, Gln34, y la interrupción del enlace de hidrógeno entre Thr38 y Val240 . El paisaje conformacional trazado por las distancias42,44 de la puerta periplásmica (Thr38–Val240) y la puerta citoplasmática (Met128–Pro332) muestreadas en las simulaciones MD muestra que los parámetros de orden separan bien las conformaciones ocluidas y las que miran hacia afuera (gráficos rojo y amarillo, Fig. .5 recuadro). Sin embargo, la única trayectoria que acompaña al giro Gln34 muestra una transición completa que cubre las estructuras cristalinas ocluidas y orientadas hacia el exterior del punto final (puntos azules en el recuadro de la Fig. 5). El mecanismo del cambio conformacional que puede ser desencadenado por un solo cambio de cadena lateral, junto con la flexibilidad estructural facilitada por la alta proporción de glicina, probablemente explique la rápida renovación catalítica exhibida por OxlT12.

Estas observaciones estructurales implican que OxlT utiliza la arquitectura MFS y evolucionó de acuerdo con una simbiosis favorable entre los animales huéspedes y los microbios intestinales. Las características estructurales y funcionales de OxlT probablemente también sean la base de las de los otros miembros de la familia OFA. Aproximadamente 2000 miembros de la OFA están registrados en la base de datos45 y todos, excepto OxlT, no están caracterizados funcionalmente. Por lo tanto, este estudio también contribuye a comprender familias de proteínas "oscuras" desconocidas. Aclarar las conformaciones orientadas hacia adentro de OxlT (un círculo punteado en el recuadro de la Fig. 5) es el próximo desafío para comprender la biología estructural de OxlT.

Todos los experimentos con animales se ajustaron a las pautas de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de Japón y fueron aprobados por el Comité de experimentación con animales de la Universidad de Tokio (número de permiso: RAC07101).

OxlT marcado con nona-His C-terminal de la cepa OxB46 de O. formigenes se expresó en E. coli XL3 a 20 °C durante 24 h con isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM47. Las células bacterianas se suspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, acetato de potasio 200 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, MgCl2 5 mM, DNasaI 20 µg/ml y lisozima 0,23 mg/ml, pH 8,0) y luego se rompieron usando EmulsiFlex C-5 (Avestin). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (9600 xg durante 30 min) y luego se recogieron las membranas celulares por centrifugación (185000 xg durante 1 h). La fracción de membrana se solubilizó con n-dodecil-β-d-maltósido (DDM) 40 mM en tampón A (HEPES-KOH 20 mM, acetato de potasio 200 mM, oxalato de potasio 10 mM y glicerol al 20%, pH 8,0) y se aplicó a Resina Ni-NTA Superflow (QIAGEN) o crudo HisTrap FF (GE Healthcare) en una columna XK16 (GE Healthcare). La columna se lavó con tampón A que contenía DDM 1 mM e imidazol 30–50 mM, y luego la proteína se eluyó con tampón A que contenía DDM 1 mM e imidazol 250 mM.

Se preparó un antígeno de proteoliposoma reconstituyendo OxlT funcional purificado a alta densidad en vesículas de fosfolípidos que consisten en una mezcla 10:1 de fosfatidilcolina de huevo (PC) (Avanti Polar Lipids) y adyuvante lípido A (Sigma) para facilitar una respuesta inmune. Se inmunizaron ratones BALB/c (hembras de 7 semanas) con el antígeno de proteoliposoma utilizando tres inyecciones en intervalos de dos semanas. Los ratones se mantuvieron en condiciones con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a una temperatura ambiente de 23 ± 3 °C y una humedad del 40–60 %.

Los anticuerpos monoclonales de ratón contra OxlT se seleccionaron como se describió previamente48. Se generaron líneas celulares de hibridoma productoras de anticuerpos utilizando un protocolo de fusión convencional. Los clones de hibridoma que producían anticuerpos que reconocían los epítopos conformacionales en OxlT se seleccionaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas liposómicas (ELISA) en vesículas de fosfolípidos inmovilizados que contenían OxlT purificado, lo que permitió una selección positiva de los anticuerpos que reconocían la conformación nativa de OxlT. Se utilizó un cribado adicional para la unión reducida de anticuerpos a OxlT desnaturalizado con SDS para la selección negativa frente a anticuerpos que reconocen epítopos lineales. La formación de complejos estables entre OxlT y cada clon de anticuerpo se comprobó con cromatografía de exclusión por tamaño con detección de fluorescencia. Las moléculas de IgG completas, recolectadas del sobrenadante de cultivo a gran escala de hibridomas monoclonales y purificadas mediante cromatografía de afinidad con proteína G, se digirieron con papaína y los fragmentos Fab se aislaron mediante filtración en gel HiLoad 16/600 Superdex200 seguida de cromatografía de afinidad con proteína A. La secuencia del Fab se determinó mediante 5'-RACE estándar utilizando ARN total aislado de células de hibridoma.

Los fragmentos Fv monocatenarios (scFv) contra OxlT se seleccionaron de una biblioteca de anticuerpos exhibida en fagos de ratón inmunizado49. Los ratones inmunizados se sacrificaron y su ARN de esplenocitos se aisló y convirtió en ADNc mediante PCR de transcripción inversa. El repertorio de VL y VH se ensambló a través de un enlazador flexible de 18 aminoácidos y se clonó en el vector de presentación de fagos pComb3XSS. Los proteoliposomas biotinilados se prepararon reconstituyendo OxlT con una mezcla de PC de huevo y 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinilo) (16:0 biotinilo Cap-PE; Avanti), y se usaron como aglutinantes. dianas para la selección de fagos scFv. Los objetivos se inmovilizaron en perlas paramagnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynabeads) o microplacas recubiertas de estreptavidina (Nunc). Después de cuatro rondas de bioselección, se realizaron ELISA de liposomas en extractos periplásmicos de colonias individuales. Los clones positivos se recolectaron y evaluaron usando un Biacore T100 (GE Healthcare).

Los fragmentos de scFv de anticuerpo no son deseables para su uso como acompañantes de cristalización porque pueden formar intermolecularmente dímeros de dominio intercambiado, y el equilibrio dímero-monómero puede aumentar la heterogeneidad estructural. Por lo tanto, usamos fragmentos Fv para ensayos de cristalización. El fragmento Fv se expresó en Brevibacillus choshinensis utilizando el sistema iRAT50. El sobrenadante del cultivo se ajustó a una saturación de sulfato de amonio del 60 % y el precipitado se sedimentó, se disolvió en tampón TBS (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, 150 mM y NaCl) y se dializó durante la noche contra el mismo tampón. Las proteínas dializadas se mezclaron con resina Ni-NTA equilibrada con tampón B (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM e imidazol 20 mM). Las proteínas unidas se eluyeron con tampón C (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM e imidazol 250 mM), se mezclaron con TEV-His6 y se dializaron durante la noche contra tampón TBS. La etiqueta His6 escindida y TEV-His6 se eliminaron utilizando una columna HisTrap equilibrada con tampón B. El fragmento Fv sin etiqueta se concentró y se cargó en una columna HiLoad16/60 Superdex75 (GE Healthcare) equilibrada con tampón TBS. Las fracciones máximas se agruparon, se concentraron, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Para la cristalización de OxlT unido a oxalato en complejo con D5901Fab, el OxlT purificado se mezcló con D5901Fab purificado en una proporción molar de 1:1,3 a 4 °C durante la noche y se aplicó a una columna HiLoad 16/60 Superdex200 pg (GE Healthcare) usando tampón D ( MES-KOH 20 mM, acetato de potasio 200 mM, oxalato de potasio 10 mM, glicerol al 20 % y DDM 0,51 mM, pH 6,2) como tampón de ejecución. La muestra purificada se dializó en tampón E (MES-KOH 20 mM, oxalato de potasio 10 mM y DDM 0,51 mM, pH 6,2). Los cristales se obtuvieron mediante el método de difusión de vapor de gota sentada a 20 °C mezclando la muestra purificada (~10 mg/mL) con una solución de depósito de citrato de sodio 0,1 M, pH 5,5, NaCl 0,05 M y 26 % (v/v) PEG400. Los cristales se congelaron en nitrógeno líquido antes de la recopilación de datos.

Para la cristalización de OxlT libre de ligando complejado con 20D033Fv, se mezcló OxlT purificado con 20D033Fv purificado en una proporción molar de 1:2 a 4 °C durante la noche y se purificó usando Superdex200 Increment 10/300 GL (GE Healthcare) en tampón F (20 mM MES -KOH, acetato de potasio 100 mM, oxalato de potasio 10 mM y DDM al 0,02%, pH 6,2). La muestra purificada se reconstituyó en una mesofase lipídica. La mezcla de proteína-LCP contenía solución de proteína al 50 % (p/p), monooleína al 45 % (p/p) (Sigma) y colesterol al 5 % (p/p) (Sigma). La mesofase lipídica resultante se dispensó como gotas de 50 μl en placas de vidrio de 96 pocillos y se cubrieron con 0,8 μl de solución precipitante utilizando un robot de cristalización NT8-LCP (Formulatrix) y luego se cubrieron con cubreobjetos delgados. Las configuraciones de cristalización y las placas sándwich de vidrio de 96 pocillos (dimensión molecular) se incubaron a 20 °C. Los cristales se obtuvieron en una semana en las siguientes condiciones de precipitación: glicina 100 mM, pH 9,0, 26–36 % (v/v) PEG400 y 50–150 mM MnCl2. Los cristales se recolectaron directamente de la mesofase lipídica utilizando Mesh Litholoops (Protein Wave) y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido.

Los datos de difracción de rayos X para OxlT unido a oxalato y para OxlT sin ligando se recopilaron a 1,0 Å en la línea de luz SPring-8 BL41XU usando MX225HE (Raynoix) y BL32XU usando un detector EIGER X 9 M (Dectris, Ltd), respectivamente. bajo un control de BSS51 y un flujo criogénico que opera a 100 K. Los datos se combinaron, integraron y escalaron a 2,6 Å (OxlT unido a oxalato) y 3,1 Å (OxlT sin ligando) utilizando el sistema KAMO52, que aprovecha BLEND53, XDS54 y XSCALE55 (Cuadro complementario 1). Los datos se corrigieron por anisotropía usando el servidor STARANISO56. La corrección eliminó muchos reflejos débiles con una integridad esférica muy baja en las capas de mayor resolución. Para el refinamiento, utilizamos datos de 3,0 Å (OxiT unido a oxalato) y 3,3 Å (OxiT libre de ligando) que contenían más del 25 % (OxiT unido a oxalato) y 22 % (OxiT libre de ligando), respectivamente, de la datos en el caparazón más alto. La estructura cristalina se resolvió usando reemplazo molecular con PHASER57. Los modelos de búsqueda fueron estructuras de mitades N- y C-terminales del transportador de glicerol-3-fosfato GlpT (PDB ID: 1PW4)58 y un fragmento Fab (PDB ID: 1XF4)59 para OxlT unido a oxalato, y estructuras de N - y mitades C-terminales de OxlT unida a oxalato determinadas en este estudio (residuos 11–199 y 204–404, respectivamente) y un fragmento scFv (PDB ID: 5B3N)60 para OxlT sin ligando. Los modelos de estructura se reconstruyeron manualmente con COOT61 y se refinaron con Phenix62. En el cristal OxlT sin ligando, se encontraron dos unidades de OxlT (cadena A y D) en una unidad asimétrica. No se observaron diferencias estructurales significativas entre los dos (Cα RMSD de 0,365 Å para los residuos 15–410). Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se muestran en las tablas complementarias 1 y 2. Las estadísticas de Ramanchandran analizadas con MolProbity63 fueron 97,8 % favorecidas, 2,2 % permitidas y 0,0 % de valores atípicos para OxlT unido a oxalato, y 97,5 % favorecidas, 2,5 % permitidas y 0,0 % de valores atípicos para OxlT libre de ligando.

La unión al ligando de OxlT se evaluó utilizando el ensayo de desplazamiento térmico de GFP (GFP-TS)35. El vector de expresión para OxlT de fusión GFPuv C-terminal se construyó previamente23, y las mutaciones se introdujeron en el vector mediante PCR utilizando PrimeSTARMax (Takara Bio) y los cebadores de oligonucleótidos enumerados en Datos complementarios 1. La proteína se expresó en BL21 (DE3) básicamente como se describe en la subsección "Preparación de OxlT", donde la producción de proteína se inició a una OD600 de 0,8 a 0,9 y se indujo a 20 °C durante 20 h.

Las células bacterianas que expresan la fusión OxlT de GFPuv C-terminal se suspendieron en tampón G (HEPES-KOH 20 mM, acetato de potasio 300 mM, pH 7,0) y se rompieron mediante sonicación usando UD201 (TOMY). Para obtener una fracción de membrana, los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación (17 800 × g durante 15 min a 4 °C) y, a continuación, los sobrenadantes se centrifugaron a 252 000 × g durante 30 min a 4 °C. Las fracciones de membrana se lavaron dos veces repitiendo la suspensión con tampón G seguido de ultracentrifugación a 252 000 xg durante 30 min a 4 °C. Las fracciones de membrana de un cultivo de 20 ml se solubilizaron con 240 o 480 µl de tampón G que contenía DDM al 1 % (p/v). Después de una solubilización a 4 °C durante 1 h, los materiales insolubles se eliminaron mediante ultracentrifugación 161 000 × g durante 20 min a 4 °C.

Para los ensayos mutantes, las proteínas OxlT-GFPuv mutantes y de tipo salvaje solubilizadas con detergente se diluyeron con tampón G que contenía DDM al 1% para ajustar la concentración de OxlT-GFPuv dando las mismas intensidades fluorescentes. A continuación, las soluciones se incubaron durante 1 h en hielo en presencia o ausencia de oxalato de potasio 3 mM. Para los ensayos de ligandos, la solución OxlT-GFPuv de tipo salvaje se incubó en presencia o ausencia de oxalato de sodio, malonato de sodio o succinato de sodio 10 mM. Después de la incubación, se añadió octil-β-d-glucósido en tampón G hasta una concentración final del 1 %, y las soluciones se sometieron a desnaturalización por calor a 30–80 °C durante 10 min utilizando un termociclador C-1000 Touch (BIO -RAD). Luego, las fracciones agregadas se eliminaron centrifugando las soluciones a 10 740–15 340 × g (14 000 rpm usando un rotor TOMY PCR96-02, dependiendo de las posiciones de los tubos en el rotor) durante 20 min a 4 °C. Los sobrenadantes resultantes se dividieron en alícuotas en una microplaca negra de bajo volumen de 384 pocillos (Corning) y las intensidades de fluorescencia se midieron utilizando un Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific) a una longitud de onda de excitación de 395 nm y una longitud de onda de emisión de 507 nm. Las intensidades de fluorescencia observadas se restaron con las del fondo del tampón y se normalizaron estableciendo los valores de la muestra sin desnaturalización por calor en 1 y el fondo en 0. Los valores de la temperatura aparente de fusión (Tm) se estimaron ajustando los valores de intensidad de fluorescencia a los Ecuación de Gibbs-Helmholtz64 usando Kaleidagraph (Hulinks), asumiendo que la proteína de interés está en un equilibrio entre un estado de plegamiento y desplegado y estableciendo los cambios de entalpía y capacidad calorífica de desplegado (ΔH, ΔCp) y Tm como variables independientes. Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional de dos caras con la prueba de Dunnett usando el tipo salvaje (WT) como referencia en Prism 8 (GraphPad). La significación estadística se define como *P < 0,05.

La actividad de transporte de OxlT se evaluó utilizando un sistema in cellulo con células de E. coli recombinantes y un sistema in vitro con proteoliposomas reconstituidos con OxlT purificado. Para los ensayos de OxlT mutante, se introdujeron mutaciones en el vector de expresión de OxlT, pRSF-OxlT36, mediante PCR usando PrimeSTARMax y los cebadores de oligonucleótidos enumerados en Datos complementarios 1.

En el ensayo in cellulo, la actividad de OxlT se midió acoplando la transferencia de protones hacia el interior impulsada por la luz mediante la xenorrodopsina coexpresada en E. coli, como se describió anteriormente36. Brevemente, las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con los vectores de expresión para OxlT y xenorrodopsina se cultivaron a 37 °C, y la producción de proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y todo trans retinal (Sigma) 10 µM a una absorbancia de 0,8–0,9 a 600 nm. Después de un cultivo a 20 °C durante 20 h, las células de E. coli se recogieron por centrifugación y se suspendieron con K2SO4 50 mM hasta una densidad celular con una DO a 660 nm de ~10. El cambio de pH de la suspensión celular inducido por la luz se controló con un electrodo de pH a 25 °C usando agitación continua. La suspensión celular se colocó primero en la oscuridad hasta que se estabilizó el pH de la muestra. A continuación, la muestra se iluminó con una lámpara Xe a través de un filtro Sharp Cut Y44 (un filtro de paso largo a ≥420 nm, HOYA) durante 10 min y se controló el cambio de pH en ausencia de oxalato (ΔpH0). La intensidad de la luz se ajustó a ~150 mW/cm2 a 550 nm utilizando un medidor de potencia óptica y un sensor óptico. La muestra iluminada se volvió a colocar en la oscuridad y cuando el pH se estabilizó, se añadió oxalato de potasio 5 mM a la muestra para permitir el transporte a través de OxlT durante 10 min. La muestra se iluminó de nuevo en las mismas condiciones que antes y se controló el cambio de pH (ΔpHS). La actividad de transporte se evaluó por la diferencia en el cambio de pH (ΔΔpH) entre ΔpHS y ΔpH0; esto se corrigió aún más restando el cambio de pH diferencial de fondo (ΔΔpH) medido con E. coli que expresaba xenorrodopsina sola. Las actividades de cada mutante se normalizaron mediante el ΔΔpH corregido y el nivel de expresión relativo, analizados mediante transferencia de Western utilizando Penta∙His Antibody (QIAGEN, Cat. No. 34460, dilución 1:2000), de OxlT de tipo salvaje medido en el el mismo día del experimento (Fig. 14 complementaria; las transferencias sin recortar están en el archivo de datos de origen). También realizamos un ensayo para el mutante Y150A; sin embargo, este mutante afectó el nivel de expresión de xenorrodopsina debido a razones desconocidas (Fig. 14 complementaria) y, por lo tanto, excluimos el resultado Y150A de este documento.

En el ensayo in vitro, las proteínas WT y OxlT mutante se expresaron y purificaron como se describe anteriormente y en la subsección "Preparación de OxlT" con modificaciones menores. Las proteínas OxlT se eluyeron de resina Ni-NTA en ausencia de glicerol en el tampón de elución y se purificaron en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) equilibrada con MES-KOH 20 mM, acetato de potasio 200 mM , DDM 0,2 mM, pH 6,2. Las fracciones monoméricas se agruparon, se concentraron a ~1 mg/ml, se complementaron con glicerol al 20 % (v/v), se cuantificaron, se dividieron en alícuotas y se congelaron instantáneamente para su uso posterior. Los proteoliposomas se prepararon de manera similar a lo descrito en Lee et al.65. El extracto de lípidos totales de E. coli (Avanti, en cloroformo) se dividió en alícuotas en tubos de vidrio y el disolvente se evaporó durante más de 5 min a temperatura ambiente bajo una corriente de gas nitrógeno. Para obtener vesículas unilaminares, los lípidos secos de E. coli se resuspendieron a 6,7 ​​mg/ml en una solución que contenía MOPS-KOH 50 mM y formiato de potasio 10 mM, pH 7,0, y se sonicaron durante 45 segundos en un sonicador de baño de agua. La vesícula unilamelar se reconstituyó con las variantes de OxlT purificadas a una relación lípido:proteína de 200:1 (p/p) o con el volumen equivalente del tampón de control (50 mM MOPS-KOH con 1,57 mM DDM, el mismo volumen que la solución de OxlT ) en microtubos mediante tres ciclos de congelación y descongelación utilizando nitrógeno líquido y baños de agua. Las vesículas unilamelares reconstituidas se sonicaron tres veces durante 15 s en total usando un dispositivo de sonda manual en hielo para formar (proteo) liposomas con un diámetro de <200 nm.

Los ensayos de captación de oxalato se iniciaron añadiendo oxalato de potasio 50 mM a la solución de liposomas a 20 °C. Antes de comenzar los experimentos, la resina de intercambio aniónico AG1-X8 (BioRad) se equilibró con un volumen 1:1 (p/v) de acetato de sodio 150 mM, pH 8,2, y se preparó centrifugando 400 μL de suspensión durante 1 min a 700ºC. ×g y 4 °C en una columna de centrifugado. En total, se recogieron 50 μL de reacción inmediatamente o después de la incubación durante el tiempo indicado en las figuras. Al aplicar las soluciones de reacción en las columnas giratorias AG1-X8 y centrifugar durante 1 min a 700 xg y 4 °C, se eliminaron los iones de oxalato fuera de los liposomas y las muestras se recogieron en un microtubo. Posteriormente, se añadieron 5 μL de una solución al 10 % (p/v) de Triton-X100 (Nacalai tesque) a cada muestra para disolver los liposomas que contenían iones de oxalato que se transportaron o se adhirieron al liposoma. Las concentraciones relativas de oxalato se determinaron utilizando el kit de ensayo de oxalato oxidasa (OxOx) (Abcam) junto con una reacción de oxidación utilizando OxOx recombinante (B. subtilis, Biovision). Se mezclaron 10 μL de lisado de liposomas con 10 μL de tampón de detección (9 μL de tampón de ensayo OxOx, 0,4 μL de convertidor OxOx, 0,2 μL de sonda roja, 0,02 μg de OxOx, hasta 10 μL con agua) en cada pocillo de una placa de 384 pocillos de bajo volumen (Corning) con una pipeta multicanal. La placa fue leída inmediatamente por Varioskan Flash en modo cinético fluorométrico con excitación a 535 nm (ancho de banda de 12 nm), emisión a 587 nm, tiempo de integración de 200 ms e intervalos de 20 segundos para un total de 83 min a temperatura ambiente. Las pendientes iniciales de las curvas de fluorescencia-tiempo se determinaron mediante regresión lineal en los primeros datos de 600 s y se interpretaron como las velocidades iniciales de la reacción OxOx, que se correlacionaron linealmente con la concentración de oxalato en esta condición de ensayo (Fig. 6 complementaria) . Se realizaron al menos dos preparaciones de liposomas independientes y ensayos de transporte de oxalato para las variantes OxlT y el control negativo, y los ensayos OxOx se realizaron por duplicado o cuadriplicado para cada condición. El gráfico de barras final muestra los valores normalizados a la media de los datos de WT a los 60 min.

Los datos (aquellos a los 60 min en el caso del ensayo in vitro) se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional bilateral con la prueba de Dunnett en Prism 8 usando el WT como referencia. La significación estadística se define como *P < 0,05.

Las estructuras cristalinas OxlT se usaron como estructuras iniciales, con residuos faltantes en el bucle central modelado con MODELLER66. Los estados de protonación se analizaron utilizando PROPKA 3.167,68, con el parámetro predeterminado. Según el análisis, Lys355 muestra un valor de pKa desviado de 7,00 en la estructura orientada hacia el exterior. Esta desviación no se observó en la estructura ocluida (valor pKa de 8,61). Por lo tanto, ambos estados de protonación para Lys355 se consideraron en el estado orientado hacia el exterior. La proteína OxlT se incrustó en la membrana utilizando el complemento Membrane Builder en CHARMM-GUI69,70. Se utilizó una bicapa de 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina (POPE) con una longitud de 120 Å para las dimensiones x e y. El lípido PE es un componente principal tanto en O. formigenes71, del que se deriva OxlT, como en E. coli72, en el que se realizaron ensayos de transporte. Además, no hay evidencia de que se requieran otros lípidos específicos para la actividad de OxlT. El sistema proteína-membrana se solvató con moléculas de agua TIP3P y KCl 150 mM, lo que dio como resultado una longitud de dimensión z de 100 Å. Luego, los 87 Cl– se reemplazaron con 58 iones de oxalato utilizando AmberTools1773 sin alterar la carga total teniendo en cuenta la carga efectiva escalada (–1.5e) del modelo de oxalato en solución (ver ECCR a continuación). El sistema MD final contenía 146015 y 143611 átomos para el sistema OxlT ocluido y orientado hacia el exterior, respectivamente. Luego se realizaron simulaciones MD utilizando NAMD 2.1274. Se emplearon los campos de fuerza Amber ff14SB y Lipid14 para describir la proteína y la membrana, respectivamente75,76. El ligando oxalato en solución se describió con parámetros determinados por la corrección continua electrónica con reescalado (ECCR), basada en la simulación Dinámica Molecular Ab Initio, desarrollada por Kroutil et al.43,77. El ligando oxalato en el sitio de unión de OxlT se describió utilizando parámetros determinados por el esquema de Potencial Electrostático Restringido (RESP)78 sin aplicar la corrección ECCR, considerando que el ambiente proteico es diferente al de la solución acuosa. Los cargos RESP han sido calculados por el software Antechamber79. Hasta donde sabemos, ningún estudio ha simulado aún oxalato complejado con proteína, aunque varios estudios MD han simulado la solvatación del anión oxalato a granel, su complejación con catión calcio y el proceso de adsorción superficial80,81,82. El sistema MD se configuró con una minimización de 10 000 pasos, se calentó de 0 a 10 K con un paso de 0,1 ns por grado en conjunto NVT, luego de 10 a 310 K en NPT con un paso de 0,2 ns por 30 grados y 10 ns de equilibrio con simulación de conjunto NPT a 310 K. Luego, se realizaron corridas de producción de 1.0 y 1.7 μs en condiciones NPT para el sistema OxlT ocluido y orientado hacia afuera (para cada estado de protonación de Lys355), respectivamente. Se mantuvo una temperatura de 310 K con el termostato Langevin, con la presión ajustada a 1 atmósfera mediante el pistón Nosé-Hoover Langevin. Se aplicaron condiciones de contorno periódicas y las interacciones electrostáticas de largo alcance se trataron mediante el método Ewald de malla de partículas con un límite de espacio real de 12 Å y una función de conmutación de 10 Å. El paso de tiempo de integración fue de 2 fs.

Para establecer el sistema de simulación con formiato, se reemplazó un resto carboxilato del oxalato que apuntaba hacia Lys355 con un átomo de hidrógeno en la estructura ocluida unida al oxalato para generar la estructura inicial del complejo formiato-OxlT. Además, se eliminó un ion K+ del modelo anterior y se reemplazó con una molécula de agua para compensar la pérdida de carga negativa. Para el formiato se utilizaron los parámetros del campo de fuerza GAFF79. Se llevaron a cabo los mismos protocolos de equilibrio y producción descritos anteriormente. La relajación total de la proteína OxlT al final del paso de equilibrio garantiza un buen ajuste del sitio de unión para un ligando más pequeño, así como una conformación realista para las tandas de producción.

Como resumen de los sistemas de simulación, hemos construido cuatro sistemas con diferentes combinaciones de la estructura inicial (estructura ocluida o abierta hacia afuera), el estado de protonación de Lys355 y el ligando unido (oxalato o formiato; en el caso de la estructura ocluida estructura). En la Tabla complementaria 5, se resumen estos sistemas de simulación, así como el número de trayectorias y el tiempo total de simulación.

La energía libre de unión relativa del oxalato a OxlT se calculó mediante el método MM/GBSA implementado en el programa MMPBSA.py83. En el método MM/GBSA, la energía libre de unión se descompone en energías de fase gaseosa y de solvatación, que se calculan mediante el campo de fuerza de la mecánica molecular (MM) y el modelo de solvente implícito de Born generalizado con el área de superficie accesible al solvente (GBSA), respectivamente. Tenga en cuenta que el efecto de la entropía no se incluyó en el cálculo. Analizamos una trayectoria que representa la transición conformacional del estado ocluido al abierto hacia afuera (Fig. 4d, f y Fig. 13a complementaria). La trayectoria se dividió en tres etapas: la OxlT ocluida con el diedro de oxalato ~50° (0–40 ns; denotada como OxlT-occ-dih50), la OxlT ocluida con el diedro de oxalato ~90° (41–320 ns; OxlT -occ-dih90) y el OxlT abierto hacia afuera con el diedro de oxalato ~90° (321–1000 ns; OxlT-op-dih90). La energía libre de enlace MM / GBSA se determinó para cada etapa de la trayectoria (consulte la Tabla complementaria 4).

La densidad del agua durante la simulación se calculó mediante un módulo de MDAnalysis84 después de centrar y superponer la proteína.

Se emplearon varios modelos QM/MM con la estructura unida al oxalato (PDB ID 8HPK) para evaluar la relevancia del entorno del sitio de unión para la conformación interna del oxalato. Primero, el ligando de oxalato se asignó a la parte QM mientras que la proteína completa se asignó a la parte MM. En segundo lugar, se añadió a la parte QM la primera capa de residuos que interaccionan directamente con el ligando (Gln34, Tyr35, Tyr124, Arg272 y Lys355). En tercer lugar, se añadió la segunda capa del sitio de unión (Tyr150, Trp324, Tyr328 y Trp352) a la parte de QM para crear un entorno de sitio de unión completo que rodee al ligando de oxalato. Todos los cálculos de QM/MM se realizaron con ONIOM85, implementado en Gaussian 1686. Se utilizó el método de la teoría funcional de la densidad (DFT)87,88 para tratar la región QM en el nivel de teoría B3LYP/6-31 + G(d,p)89 ,90, incluyendo la corrección de dispersión de Grimme con amortiguamiento de Becke-Johnson (D3BJ)91. La región MM del sistema fue descrita por el mismo campo de fuerza que en las simulaciones MD. El esquema de incrustación electrónica se utilizó de tal manera que la región MM polariza la densidad electrónica QM. Se agregó un átomo de enlace explícito entre los carbonos α y β para cada residuo ubicado en la región QM para manejar el límite covalente entre las partes QM y MM. Los mínimos de la superficie de energía potencial se confirmaron al no tener frecuencias imaginarias. Se realizaron cálculos DFT puros adicionales del ligando de oxalato con cadenas laterales fijas de los residuos del sitio de unión con el mismo nivel teórico de QM que en los cálculos de QM/MM. Al igual que con los cálculos QM/MM, las estructuras optimizadas, obtenidas como puntos estacionarios en la superficie de energía potencial, eran verdaderos mínimos energéticos sin frecuencias imaginarias.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas y los factores de estructura de OxlT se han depositado en el Protein Data Bank con los números de acceso 8HPK (complejo OxlT-fab; forma ocluida unida a oxalato)92 y 8HPJ (complejo OxlT-Fv; forma orientada hacia el exterior sin ligando)93. Los datos relacionados con MD se han depositado en el repositorio de Zenodo [https://doi.org/10.5281/zenodo.7597686]94. En este estudio se utilizaron las coordenadas con los ID de PDB 1PW458, 1XF459, 5B3N60, 4U4W95, 4U4T96 y las secuencias de aminoácidos de la familia OFA (IPR026355). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a los Dres. Kazuya Hasegawa, Hideo Okumura, Yoshiaki Kawano y Kunio Hirata, SPring-8, por el soporte de recopilación de datos de difracción de rayos X; Yayoi Nomura, Yoshiko Nakada-Nakura y Yumi Sato por su asistencia técnica en la generación de anticuerpos; Kyoko Fujita por su asistencia técnica con los ensayos funcionales; y al profesor Keietsu Abe por sus valiosos consejos sobre los ensayos funcionales OxlT. Los experimentos de radiación de sincrotrón se realizaron en BL41XU y BL32XU de SPring-8 y con las aprobaciones del Instituto de Investigación de Radiación de Sincrotrón de Japón (JASRI) (Propuesta No. 2012B1096, 2015A1080, 2015B2080). Los cálculos se realizaron parcialmente utilizando el Centro de Investigación de Ciencias Computacionales, Okazaki, Japón (Proyecto: 21-IMS-C175, 22-IMS-C189). Este trabajo fue apoyado financieramente por JSPS KAKENHI Grant Numbers JP20H03195 (para AY), JP18H02415 (para KO), JP26440086 (para TH) y Research Fund from Koyanagi Foundation (para AY), Takeda Science Foundation (para Ta.S.), the Proyecto de plataforma para apoyar el descubrimiento de fármacos y la investigación en ciencias de la vida [Base para apoyar el descubrimiento de fármacos innovadores y la investigación en ciencias de la vida (BINDS)] de AMED con la subvención no. JP20am0101079 (a SI). Los autores desean agradecer a Enago (www.enago.jp) por la revisión en inglés.

Centro de Investigación de Ciencias Computacionales, Instituto de Ciencias Moleculares, Institutos Nacionales de Ciencias Naturales, Okazaki, 444-8585, Japón

Titouan Jaunet-Lahary y Kei-ichi Okazaki

Escuela de Graduados en Medicina, Universidad de Kyoto, Kyoto, 606-8501, Japón

Tatsuro Shimamura, Norimichi Nomura, Kouta Hirasawa y So Iwata

Escuela de Posgrado en Medicina, Odontología y Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Okayama, Okayama, 700-8530, Japón

Masahiro Hayashi, Naotaka Tsutsumi, Keiichi Kojima, Yuki Sudo y Atsuko Yamashita

Centro RIKEN SPring-8, Sayo, 679-5148, Japón

Tetsuya Shimizu, Masao Yamashita, Teruhisa Hirai y Atsuko Yamashita

Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Okayama, Okayama, 700-8530, Japón

Naotaka Tsutsumi, Yuta Suehiro y Atsuko Yamashita

Escuela de Graduados en Ciencias Ambientales y de la Vida, Universidad de Okayama, Okayama, 700-8530, Japón

Takashi Tamura

Centro de Investigación de Ciencia y Tecnología Avanzadas, Universidad de Tokio, Tokio, 153-8904, Japón

Hiroko Iwanari y Takao Hamakubo

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Te.H. y AY concibió el estudio. Te.S., MY, Ta.S., KH y NN realizaron la purificación de proteínas. NN, HI, Ta.H. y SI realizaron la preparación de anticuerpos. Te.S., MY, AY, Te.H., Ta.S. y KH realizaron la cristalización y la recopilación de datos de rayos X. Ta.S., Te.H., MH y AY realizaron el análisis de la estructura. MH, NT, Yut.S., KK, AY y Yuk.S. realizó los ensayos funcionales. TJL y KO realizaron simulaciones de dinámica molecular y QM/MM. TT realizó una simulación de dinámica molecular preliminar. AY, KO, Ta.S., NN, TJL, MH, NT y Yut.S. escribió el artículo, junto con las aportaciones de todos los demás autores.

Correspondencia a Tatsuro Shimamura, Kei-ichi Okazaki, Teruhisa Hirai o Atsuko Yamashita.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Lan Guan y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Jaunet-Lahary, T., Shimamura, T., Hayashi, M. et al. Estructura y mecanismo del transportador de oxalato OxlT en una bacteria degradadora de oxalato en la microbiota intestinal. Nat Comun 14, 1730 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5

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Recibido: 01 noviembre 2021

Aceptado: 20 febrero 2023

Publicado: 03 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36883-5

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